SCT 9435-2019 水产养殖环境（水体、底泥）中孔雀石绿的测定高效液相色谱法.pdf

SC/T9435-2019水产养殖环境（水体、底泥）中孔雀石绿的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了水产养殖环境（水体、底泥）中孔雀石绿的高效液相色谱测定方法的原理、试剂和材料、仪器和设备、分析步骤、结果计算、精密度和定量限。本标准适用于水产养殖环境（水体底泥）中孔雀石绿的测定2规范性引用文件PUBLISZ凡是不注日期的引用文件，其最新烟包括所有的修致单)适用于GB/T6682分析实验室用规格和试验方法GB17378.5海洋监侧挑范第5部分沉积物分析3原理RES孔雀石绿经硼氢化御还原为其代谢广物隐色孔雀石绿后水样经过滤，底泥试样经乙腈和上氯甲烷混合溶剂提取，所得样液加甲酸酸化，经固相萃取柱富集、净化，反相色谱柱分离，责光泾测器检测，外标法定量。4试剂和材料54.1试剂4.1.1水：符合GB/T6682中级水的要求。4.1.2乙腈(C2HN):色纯4.1.3甲醇(CHOD4.1.4二氯甲烷(CH,Cl谐RCH CENTER4.1.5甲酸(CH202):分桥纯蚣4.1.6冰乙酸(CH,COOH):分析纯。4.1.7硼氢化钾(KBH):分析纯。4.1.8乙酸铵(CH COONH4):分析纯4.2溶液配制4.2.13%甲酸溶液：移取3mL甲酸，用水定容至100mL。4.2.2硼氢化钾溶液(0.03mol/L):称取0.081g硼氢化钾，用水溶解，定容至50mL,现用现配。4.2.3硼氢化钾溶液(0.2mol/L):称取0.54g硼氢化钾，用水溶解，定容至50mL,现用现配。4.2.4乙酸铵溶液(5mol/L):称取38.5g无水乙酸铵，用水溶解，定容至100mL。4.2.5乙酸铵甲醇溶液(0.25mol/L):移取5mL乙酸铵溶液用甲醇定容至100mL。4.2.6乙酸铵缓冲溶液(0.125mol/L):称取9.64g无水乙酸铵溶解于1L水中，用冰乙酸调pH至4.5。4.2.780%乙腈水：量取80mL乙腈与20mL水混合。4.3标准品f孔雀石绿草酸盐标准品Malachite green oxalate salt,2(C2sHsN2)2(CzHO,)CzH2O4,CAS号：SC/T9435-20192437-29-8:纯度98%。4.4标准溶液配制4.4.1孔雀石绿标准储备溶液：准确称取标准品，用乙腈稀释配制成100g/mL的标准储备液，一18避光保存，有效期3个月。4.4.2孔雀石绿标准中间溶液(1g/mL):吸取1.00mL孔雀石绿的标准储备溶液至100mL容量瓶，用乙腈稀释至刻度，一18避光保存。4.4.3孔雀石绿标准工作溶液：根据检测需要移取一定体积的标准中间溶液，加入0.4mL0.03mol/L硼氢化钾溶液，用乙腈准确稀释至2.00L,配置适当浓度的标准工作溶液。标准工作溶液需现配现用。4.5材料4.5.1酸性氧化铝：粒度为100目200目(75m150um)。4.5.2MCX混合型阳离子交换柱：3mL/60g。使用前，依次用3mL乙腈、3mL甲酸溶液预淋洗。4.5.3微孔滤膜：0.22um,通用型。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪：配荧光检测器。5.2电子天平：感量0.0001g、感量0.01g。5.3涡旋振荡器。5.4超声波清洗器：频率40kHz。5.5离心机：3000r/min。5.6固相萃取装置：12孔或24孔。5.7pH计。5.8可控温氮吹浓缩仪5.9注射器：50mL或100mL6分析步骤6.1样品处理6.1.1水样处理水样经0.45am滤膜过滤后，准确移取100mL水样于三角瓶中，加入1mL0.2mol/L硼氢化钾溶液，充分振荡1min2min,再加入3mL甲酸调节水样pH,待净化。6.1.2底泥处理准确称取10.00g于50mL离心管内，依次加入5g酸性氧化铝、10mL乙腈和10mL二氯甲烷、1mL0.2mol/L硼氢化钾溶液，涡旋振荡1min,超声提取10min,4000r/min离心l0min,将上清液移至100mL的三角瓶。底泥用10mL乙腈和10mL二氯甲烷，重复提取一次，合并上清液。收集液加入适量甲酸，使甲酸所占样液体积分数为3%(VV),待净化。另取10.00g底泥样品，按照GB17378.5中规定的方法进行含水率测定。6.2净化将已活化的MCX固相萃取小柱连接到固相萃取仪，将注射器通过SPE转接头连接到固相萃取柱上端，然后将水样或底泥样液加载到注射器，让样液以小于3mL/min流速通过小柱。样品过柱后，以5mL乙腈清洗三角瓶，转入小柱，弃去流出液，减压抽干。用5mL0.25mol/L乙酸铵甲醇溶液洗脱，减压抽干。将洗脱液氮吹浓缩近干，用2.00mL80%乙腈水溶液溶解残渣，经过0.22m滤膜过滤，供液相色谱分析。6.3测定6.3.1色谱参考条件2SC/T9435-2019a)色谱柱：C1s柱，250mm4.6mm(内径)，5um,或性能相当者；b)色谱柱温：35；c)流动相：乙腈+乙酸铵缓冲溶液(0.125mol/L,pH4.5)=(80+20,V/V);d)荧光检测器：激发波长265nm,发射波长360nm;c)流速：1.5mL/min:f)进样量：50L。6.3.2色谱测定与确证将标准工作溶液和待测溶液分别注入高效液相色谱中，以保留时间定性，以待测液峰面积代入标准曲线中定量，样品中孔雀石绿质量浓度应在标准工作曲线质量浓度范围内。标准溶液和试样溶液色谱图参见附录A。0LSR6.4空白实验7结果计算数字式中：STA(1)XI-水样中待侧组分的含量，单为毫克每升(mgL)C.待测组分标液工作液的浓度，单位为微克每毫升(g/L)A,待测组分标准工作液的峰面积，A样品中待测组分的峰面积：样液最终定容体积，单位为毫升(LV。一样品体积，单位为毫升(mL)底泥试样中孔雀石绿的含量按式(2计算，测试结果需扣除室白值，并保留3oid(2)式中：X2样品中待测组副残留量，单位为毫克下克g4g,样品质量，单位为党g)W样品含水率，单位为质量分数(6)8精密度在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值与其算术平均值的比值（百分率），应符合附录B的要求。在再现性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值与其算术平均值的比值（百分率），应符合附录C的要求。9定量限水体中孔雀石绿的定量限为0.1g/L:底泥中孔雀石绿的定量限为1.0gkg。