SCT 7014-2006 水生动物检疫实验技术规范.pdf

SC/T7014-2006观察是否离群独游或有其他异样游动情况，对惊吓敏感程度，摄食是否正常等。必要时对饲养环境进行调查，如对水温(t)、溶解氧(DO)、酸碱度(pH)、氨氨(NH3)、亚硝酸盐(NO2)、化学耗氧量(COD)等理化指标进行测定。7.2外部检查7.2.1鱼类体形体色的变化，体表黏液的多少，有无充血、出血等症状，鳍条、鳞片等损伤情况，鳃黏液及颜色变化，有无竖鳞、疖疮等现象，有无胞囊及其他寄生虫寄生等情况。7.2.2虾类体色及体表光滑情况，肠道食物的充盈程度，有无附着物，有无白斑、红体情况，肌肉丰满程度，有无附肢渍烂、断残等情况。7.2.3蟹类甲壳光滑程度、硬度，有无损伤情况，壳面有无溃疡、红色或棕色斑点，附肢残断或再生情况，有无附着物或其他寄生虫寄生等情况。7.2.4贝类贝壳关闭情况，贝壳有无剥落或穿孔情况，出水孔喷水情况，出水时斧足收缩入壳内情况。7.2.5蛙类腿部及腹部等损伤情况，体表黏液情况，有无体表充血、出血情况，有无寄生虫寄生等情况。7.2.6龟、鳖类甲壳圆滑、硬度情况，损伤情况，有无溃疡、红脖子情况，有无附着物或寄生虫寄生等情况。7.3解剖检查7.3.1鱼类仔细观察有无腹水，肝、脂肪、脾、胆、鳔、性腺、肠道、肾、心脏、脑、脊髓、肌肉等的颜色、大小有无变化，有无寄生虫或胞囊及其他病理变化等。7.3.2虾类仔细观察有无烂鳃、黄鳃及黑鳃情况，仔细观察胃、性腺、肝胰腺、心脏、肌肉等的颜色、大小有无变化，有无寄生虫或胞囊及其他病理变化等。7.3.3蟹类仔细观察有无烂鳃、黑鳃情况，仔细观察肝胰腺、消化道、肌肉、生殖腺等的颜色，有无寄生虫或胞囊及其他病理变化等。7.3.4贝类贝壳打开后黏液和分泌物情况及有无气味，足丝附着情况，外套膜发黑或肿胀情况，勰颜色及腐烂情况，内脏团颜色及瘦弱情况，有无附着物、寄生虫或胞囊寄生及其他病理变化等。7.3.5蛙类仔细观察胃、肠道、肝脏、胰脏、肺、心脏、肌肉、脑等的颜色、大小有无变化，有无寄生虫或胞囊及其他病理变化等。7.3.6龟、鳖类仔细观察食道、心脏、肝脏、胃、肠道、鳃腺、性腺、肌肉、脑等的颜色、大小有无变化，有无寄生虫或胞囊及其他病理变化等。7.4制片镜检7.4.1将体外凡能接触到生活水体的各部位用弯头镊子刮取黏液，放在滴有水（海水动物用煮沸过滤海水)的载玻片上，涂沫均匀，盖上盖玻片，制成水浸片，显微镜下观察。2SC/T7014-20067.4.2将体内各组织、器宫用弯头镊子取少部分，放在滴有生理盐水（淡水动物用0.65%，海水动物用0.75%)的载玻片上，涂沫均匀，盖上盖玻片，制成水浸片，显微镜下观察。8病毒分离与鉴定8.1分离病毒8.1.1取样部位有明显病灶的取病灶部位，无明显病灶的：幼苗取整体，若有卵黄则除去；全长4cm6cm鱼取头部、所有内脏；全长6cm以上鱼取脑、肝、肾、脾，若为怀卵鱼则包括卵巢液。8.1.2样品处理8.1.2.1将所采样切成小块用含双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)(见附录A.2)洗2次。8.1.2.2样品剪碎、匀浆，用10倍体积的199充分悬浮，25，1h一2h。8.1.3分离病毒8.1.3.13000r/min,离心30min,收集上清液，4过夜。8.1.3.2接种24h以内的新鲜敏感细胞。8.2病毒鉴定8.2.1氯仿敏感试验8.2.1.1将1mL病毒样品液加入一密封容器内，另取1mL作对照。8.2.1.2加1mL氯仿，对照加1mL199培养液于室温下间歇振荡10min。8.2.1.3将氯仿处理样品及未处理对照样品同时于1000r/min,离心5min,取上层水相。8.2.1.4测定处理样品和未处理对照样品中病毒的半数细胞培养感染量(TCD50)(方法见附录B)。8.2.1.5如果病毒经过氯仿处理后比未处理对照降低2个滴度以上，则认为对脂溶剂敏感，病毒可能有囊膜。8.2.2吖啶橙(A0)试验8.2.2.1有接种了病毒样品的，附有敏感细胞的盖玻片，PBS蘸洗。8.2.2.2加Carnoys固定液（见附录A.3),固定15mino8.2.2.3依次于95%、75%、50%、25%乙醇中各2min8.2.2.4加Mcilvains缓冲液（见附录A.4),8min。8.2.2.5加0.01%吖啶橙染色液（见附录A.5)5min.8.2.2.6加Mcilvains缓冲液，3min。8.2.2.710%甘油缓冲液封片。8.2.2.8荧光显微镜镜检，吖啶橙染色后双链核酸经紫外光照射发出绿光，而单链核酸发出红光。8.2.3DNA抑制剂(5-碘脱氧尿苷，即IUDR)抑制试验8.2.3.1将细胞传人24孔板或96孔板，24h内长成单层。8.2.3.2吸出培养液，加入含50 gIUDR/mL的199与HEPES(4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸)混合液。8.2.3.312h后，将待测病毒液用上述含UDR的培养液10倍系列稀释。8.2.3.4接种到细胞板，每稀释度接3孔，每孔0.1mL,根据细胞不同，选择不同温度培养。8.2.3.512h24h后换人不含IUDR的培养液，继续培养观察7d,计算TCD5o值。8.2.3.6UDR的浓度对检验结果的影响很大，因为它对细胞和病毒都有毒性，所以要有以下对照：正常细胞，用无IUDR的培养液培养（正常对照）；-正常细胞，用含IUDR的培养液培养(IUDR毒性对照)；