DB22T 2705-2017 牛瑟氏泰勒虫病检测方法 LAMP法.pdf

ICS 11.220 B 41 备案号：56318-2017 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 27052017 牛瑟氏泰勒虫病检测方法 LAMP 法 LAMP assay for detection of bovine Theileria sergenti 2017-09-30 发布 2017-11-30 实施吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27052017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 和 GB/T 20001.42015 给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心、延边朝鲜族自治州畜牧总站。本标准主要起草人：贾立军、张守发、梁晚枫、柴方红、张魁、王海军。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27052017 1 牛瑟氏泰勒虫病检测方法 LAMP 法 1 范围 本标准规定了牛瑟氏泰勒虫病 LAMP 检测方法的技术要求。本标准适用于牛瑟氏泰勒虫病原检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 3.1 瑟氏泰勒虫病 theileria sergenti 由泰勒科、泰勒属的瑟氏泰勒虫寄生于牛体内引起的以高热、贫血、出血、消瘦和体表淋巴结肿大为主要临床症状的一种血液原虫病。4 原理 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification LAMP)：针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在62 65 等温条件下，保温30 min60 min，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，即而完成的核酸扩增反应。5 试剂和溶液 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。5.1 试剂 5.1.1 Bst DNA Polymerase。5.1.2 SYBR Green。5.1.3 限制性内切酶 Taq。5.1.4 血液 DNA 提取试剂盒。5.1.5 溴化乙锭。5.1.6 DNA Marker 分子量标准。5.2 常规试剂配制 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27052017 2 5.2.1 100 mg/mL 溶菌酶见附录 A.1。5.2.2 10 mg/mL 蛋白酶 K 见附录 A.2。5.2.3 10%十二烷基磺酸钠见附录 A.3。5.2.4 5%十六烷基三甲基溴化铵见附录 A.4。5.2.5 TE（pH 8.0）见附录 A.5。5.2.6 50TAE 缓冲液见附录 A.6。5.2.7 加样缓冲液见附录 A.7。5.2.8 1.5%琼脂糖凝胶的制备见附录 A.8。5.3 引物 LAMP反应引物序列与浓度见表1。表1 LAMP 特异性引物序列及浓度 引物 引物序列 DNA 序列 浓度 F3 TCGCCCACAGACTTAAGCA 0.2mol/L B3 GAATGGTCCGACGAAGTCAT 0.2mol/L FIP GTGCATATCCGAACTGAACCCACTCATGCCAAGCCACTCT 1.6mol/L BIP AGGAAACCAAGGATCTCGATGCGGCATCAGCAGCAAAAAGAC P33 基因（D87198）1.6mol/L 5.4 仪器设备 5.4.1 低温高速离心机，12 000 r/min。5.4.2 恒温水浴锅，室温100。5.4.3 分析天平，感量 0.1 mg。5.4.4 电泳槽，水平电泳槽。5.4.5 电泳仪，电压 1 V300 V，电流 1 mA400 mA。5.4.6 凝胶成像系统（带紫外灯）。5.4.7 微量加样器，单道 2 L、10 L、20 L、100 L、200 L 和 1000 L。5.5 试验样品 对无菌采集的待检牛血液样品，封装于洁净塑料离心管或玻璃试管内，编号。冷藏条件下送实验室检测。5.6 标准样品 标准阳性样品为牛瑟氏泰勒虫基因组DNA提取物，DNA浓度为10 mg30 mg。制备方法见附录B。标准阴性样品为无瑟氏泰勒虫感染牛血液DNA提取物，DNA浓度为10 mg30 mg。6 试验步骤 6.1 LAMP 反应体系，按表 2 依次加入反应试剂，总体系 25 L。6.2 同时设置阳性对照、阴性对照和水对照。6.3 LAMP 反应条件，63 反应 60 min，80 2 min 终止反应。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27052017 3 表2 LAMP 反应体系 加样物 浓度 体积 DNA 模板 10 mg30 mg 2 L MgSO4 6.0 mmol/L 3 L dNTP 1.4 mmol/L 3.5 L F3 0.2 mol/L 1 L B3 0.2 mol/L 1 L FIP 1.6 mol/L 1 L BIP 1.6 mol/L 1 L Bst DNA Polymerase Buffer 10 2.5 L Bst DNA Polymerase 8 U/L 1 L ddH2O 9 L 总体系 25 L 7 结果判定 7.1 眼观判定 将样品反应物加入1000倍 SYBR Green I 2 L，室温放置10 min，置于凝胶成像仪的紫外灯下观察。阳性对照样品应呈现绿色荧光，阴性对照与水对照样品应呈现棕色、无荧光。在对照成立的前提下，样品呈现绿色荧光判为阳性，呈现棕色、无荧光判为阴性。具体参考标准见附录C.1。7.2 电泳判定 取样品反应物2 L加入到1.5%琼脂凝胶板的样品孔中，并设置标准阳性、阴性和标准分子量DNA Marker。将凝胶在150 V恒定电压下电泳30 min后，置于凝胶成像仪观察。阳性样品应呈现特征性梯状条带，阴性样品无条带。具体见附录C.2。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27052017 4 A A 附 录 A（规范性附录）环介导等温扩增（LAMP）常用溶液配制 A.1 100 mg/mL溶菌酶 100 mg/mL溶菌酶的配制见表A.1。表A.1 100 mg/mL 溶菌酶 溶菌酶 100 mg 灭菌双蒸水 定容至 1 mL A.2 10 mg/mL蛋白酶K 10 mg/mL 蛋白酶K的配制见表A.2。表A.2 10 mg/mL 蛋白酶K 蛋白酶 K 10 mg 灭菌双蒸水 定容至 1 mL A.3 10%十二烷基磺酸钠（SDS）10%十二烷基磺酸钠（SDS）的配制见表A.3。表A.3 10%十二烷基磺酸钠（SDS）十二烷基磺酸钠（SDS）10 g 灭菌双蒸水 定容至 100 mL 注：分装，灭菌，室温保存。A.4 5%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）5%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的配制见表A.4。表A.4 5%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）0.5 g 灭菌双蒸水 定容至 10 mL A.5 TE（pH 8.0）10 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)与1 mmol/L的EDTA（pH 8.0）等体积混合，高压灭菌。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27052017 5 A.6 50TAE缓冲液 A.6.1 0.5 mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）的配制见表A.6。表A.6 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）乙二铵四乙酸二钠 18.6 g 灭菌双蒸水 80 mL 注：用氢氧化钠溶液调pH至8.0，灭菌双蒸水定容至100 mL。A.6.2 TAE缓冲液（50）的配制见表A.7。表A.7 TAE 缓冲液（50）配制 三羟甲基氨基甲烷（Tris）24.2 g 冰乙酸 5.71 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）10 mL 注：加去离子水定容至 100 mL，室温保存备用，使用时稀释 50为工作液。A.7 加样缓冲液 加样缓冲液的配制见表A.8。表A.8 加样缓冲液 溴酚蓝 10 mg 甘油 2.5 mL 0.5 mol/L pH 6.8 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液 定容至 10 mL A.8 1.5%琼脂糖凝胶 1.5%琼脂糖凝胶的制备见表A.9。表A.9 1.5%琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖 1.5 g 1TAE 缓冲液 定容至 100 mL 将三角瓶放在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加热时不要沸出），置室温冷却到50 左右，加入10 mg/mL的溴化乙锭10 L，摇匀，倒入电泳板上，凝固，4备用。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27052017 6 B B 附 录 B（规范性附录）标准阳性对照模板 DNA 制备 标准阳性对照模板DNA制备应：a)取牛瑟氏泰勒虫病阳性血液 150 L 加入 1.5 mL 离心管中，加入溶菌酶（100 mg/mL）15 L，充分混匀，37 下 1 h；b)依次加入蛋白酶 K(10 mg/ml)9 L、10%SDS 105 L、5 mol/L NaCl 150 L、5%CTAB 240 L，充分混匀后，65 下 10 min；c)加入等体积 Tris-饱和酚和氯仿反复抽提两次，氯仿洗涤一次；d)取上层于另一 1.5 mL 离心管中，加入等体积无水乙醇和 1/10 体积醋酸钠沉淀 30 min；e)4 下 12 000 r/min 离心 15 min，弃上清；f)将 70%乙醇 100 L 沿管壁徐徐加入，4 下 12 000 r/min 离心 1 min，吸弃上清，干燥；g)用 20 L TE 溶解 DNA，取一部分测定 OD260 和 OD280，以计算所提的 DNA 浓度和纯度，其余基因组总 DNA 于-20 保存、备用。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27052017 7 C C 附 录 C（规范性附录）LAMP 扩增结果判定标准 眼观判定LAMP扩增标准见图C.1。1 2 说明：1标准阳性对照；2标准阴性对照。图C.1 LAMP 扩增后加入 SYBR Green I 紫外灯下眼观结果 电泳判定LAMP扩增标准见图C.2。说明：MDL 2000 DNA Marker；1标准阳性对照；2标准阴性对照。图C.2 电泳判定 LAMP 扩增标准阳性、阴性对照 _ D E 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印