DB22T 2704-2017 牛卵形巴贝斯虫病检测方法 PCR法.pdf

ICS 11.220 B 41 备案号：56317-2017 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 27042017 牛卵形巴贝斯虫病检测方法 PCR 法 PCR assay for detection of bovine Babesia ovata 2017-09-30 发布 2017-11-30 实施吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27042017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 和 GB/T 20001.42015 给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心、延边朝鲜族自治州畜牧总站。本标准主要起草人：贾立军、梁晚枫、柴方红、黄国明、张魁、王海军。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27042017 1 牛卵形巴贝斯虫病检测方法 PCR 法 1 范围 本标准规定了牛卵形巴贝斯虫病 PCR 检测方法的技术要求。本标准适用于牛卵形巴贝斯虫病原检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 3.1 卵形巴贝斯虫病 babesiosis 由牛卵形巴贝斯虫（Babesia ovata）寄生于牛的红细胞内，以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等为主要特征的血液寄生虫病。4 原理 双链DNA在高温加热的作用下变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则，通过人工合成的特异性寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链，再利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)合成新生的DNA互补链，进而完成特定片段的体外扩增。5 试剂和溶液 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。5.1 试剂 5.1.1 Taq DNA 聚合酶。5.1.2 dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。5.1.3 血液 DNA 提取试剂盒。5.1.4 DNA Marker 分子量标准。5.2 常规试剂配制 5.2.1 50TAE 缓冲液见附录 A.1。5.2.2 加样缓冲液见附录 A.2。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27042017 2 5.2.3 10 mg/mL 溴化乙锭见附录 A.3。5.2.4 1%琼脂凝胶见附录 A.4。5.3 引物 PCR反应引物序列与浓度见表1。表1 PCR 反应引物序列与浓度 引 物 引物序列 DNA 序列 长度/bp 浓度/pmol/L上游引物 5-GCCCGCAGGTCATCATAAAGT-3 下游引物 5-CATTTTGTGCCAGCGTTTTG-3 AB367928.11008 10 5.4 仪器设备 5.4.1 PCR 扩增仪,温度范围：4 100。5.4.2 低温高速离心机,12 000 r/min 以上。5.4.3 高压灭菌器,120 以上。5.4.4 恒温水浴锅,室温100。5.4.5 分析天平,感量 0.1 mg。5.4.6 电泳槽,水平电泳槽。5.4.7 电泳仪,电压 1 V300 V；电流 1 mA400 mA。5.4.8 凝胶成像系统,带紫外灯。5.4.9 微量加样器,单道 2 L、10 L、20 L、100 L 和 200 L。5.5 试验样品 对无菌采集的待检牛血液样品，封装于洁净塑料离心管或玻璃试管内，编号。冷藏条件下送实验室检测。6 试验步骤 6.1 模板 DNA 制备 按血液基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA见附录B。6.2 检测血样 PCR 反应 在PCR反应管中按表2依次加入反应试剂，反应体系为 25 L。反应条件为：95 预变性 5 min；94 变性 50 s，50 退火 60 s，72 延伸 50 s，循环 30 次；72 延伸 7 min，4 保存。表2 PCR 检测反应体系 试剂 体积 10PCR 缓冲液 2.5 L 2.5 mmol/L dNTP 2.0 L 表 2（续）本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27042017 3 试剂 体积 10 mol/L 上游引物 1.0 L 10 mol/L 下游引物 1.0 L 5 U/L Taq 酶 0.25 L 25 mg/L DNA 模板 2.0 L 灭菌双蒸水 16.25 L 总体积 25 L 6.3 对照 PCR 反应 在试样PCR反应的同时，设置标准阴性对照、标准阳性对照和空白对照，各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与6.2相同。以未感染卵形巴贝斯虫牛血液中提取的DNA作为标准阴性对照PCR反应体系的模板；以卵形巴贝斯虫感染牛的血液提取的DNA作为标准阳性对照PCR反应体系的模板；以无菌双蒸水作为空白对照PCR反应体系的模板。7 结果判定 7.1 标准对照 标准对照见附录C。7.2 检测样品判定 将所有样品、标准阳性对照、标准阴性对照及空白对照的PCR产物按编号加入到1%琼脂凝胶板的各孔中，将凝胶的边孔中加入标准分子量DNA Marker，将凝胶在150 V恒定电压下电泳30 min后，凝胶成像仪观察结果，判定如下：a)在凝胶成像仪下，标准阴、阳性对照成立，若待检样品出现 1008 bp 的 DNA 带，判为阳性，记作“+”，若无此带，记为“”；b)若标准阴、阳性对照不成立，则全部样品应重新检测。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27042017 4 A A 附 录 A（规范性附录）聚合酶链式反应（PCR）试验常用试剂配制 A.1 50TAE缓冲液 A.1.1 0.5 mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）的配制见表A.1。表A.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）乙二铵四乙酸二钠 18.6 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 定容至 100 mL A.1.2 TAE缓冲液（50）的配制见表A.2。表A.2 TAE 缓冲液（50）配制 三羟甲基氨基甲烷（Tris）242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）10 mL 注：加去离子水定容至100 mL，室温保存备用，使用时稀释50为工作液。A.2 加样缓冲液 加样缓冲液的配制见表A.3。表A.3 加样缓冲液 溴酚蓝 10 mg 甘油 2.5 mL 0.5 mol/L pH 6.8 的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液 定容至 10 mL A.3 10 mg/mL溴化乙锭 10 mg/mL溴化乙锭的的配制见表A.4。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27042017 5 表A.4 10 mg/mL 溴化乙锭 溴化乙锭 0.1 g水（H2O）定容至 10 mLA.4 1%琼脂糖凝胶 1%琼脂糖凝胶的制备见表A.5。表A.5 1%琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖 1 g1TAE 缓冲液 定容至 100 mL将三角瓶放在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加热时不要沸出），置室温冷却到50 左右，加入10 mg/mL溴化乙锭10 L，摇匀，倒入电泳板上，凝固后，4 备用。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27042017 6 B B 附 录 B（规范性附录）样品 DNA 的制备 DNA提取试剂盒步骤：a)在检测样品中加入 2 倍3 倍体积的红细胞裂解液，充分颠倒混匀，12000 r/min 离心 1 min，吸去上清，沉淀为白色或淡红色。向沉淀中加 200 L 溶液 A，振荡至彻底混匀；b)向悬浮液中加入 20 L（10 mg/mL）的 RNase A，充分颠倒混匀，室温放置 10 min；c)加入 20 L（10 mg/mL）的蛋白酶 K，充分颠倒混匀，65 水浴消化 30 min60 min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止；d)加入 2 倍体积溶液 B（已加入无水乙醇），充分颠倒混匀，将溶液加入吸附柱中，室温放置 2 min；e)12000 r/min 离心 2 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；f)向吸附柱中加入 700 L 漂洗液（使用前加入无水乙醇），12000 r/min 离心 1 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；g)向吸附柱中加入 500 L 漂洗液，12000 r/min 离心 1 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。h)12000 r/min 离心 2 min，将吸附柱敞口置于室温或 50 温箱放置数分钟；i)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加 50 L200 L 经 65 水浴预热的洗脱液，室温放置 5 min，12000 r/min 离心 1 min；j)离心所得洗脱液再加入吸附柱中，12000 r/min 离心 2 min，即可得到高质量的基因组 DNA；k)取一部分测定 OD260 和 OD280，以计算所提的 DNA 浓度和纯度，其余基因组总 DNA 于 4 保存。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 27042017 7 C C 附 录 C（规范性附录）标准对照 标准对照见图C.1。M 1 2 3 说明：MDL 2000 DNA Marker；1标准阴性对照；2标准阳性对照；3空白对照。图C.1 PCR 扩增标准阳性、阴性对照 _ D E 2 000 bp 1 000 bp 500 bp 200 bp 1008 bp 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印