DB15T 2506-2022 羊捻转血矛线虫检疫鉴定方法.pdf

ICS 65.020.30 CCS B41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 25062022 羊捻转血矛线虫检疫鉴定方法 Quarantine identification method of haemonchus contortus in sheep 2022-01-25 发布 2022-02-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 25062022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学、中华人民共和国呼和浩特海关、内蒙古农业大学、鄂尔多斯市东胜区动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：李军燕、罗晓平、李健、特日格勒、高娃、陈林军、王瑞、高魁、赵世华、刘秀丽、王凤武、李锋、裴乐、宋越、杨斌。DB15/T 25062022 1 羊捻转血矛线虫检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了羊感染捻转血矛线虫的诊断依据、检疫鉴定原则及鉴别诊断。本文件适用于不同饲养模式下羊捻转血矛线虫的检疫鉴定，也适用于牛、驼、鹿等动物捻转血矛线虫的检疫鉴定。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。捻转血矛线虫 haemonchus contortus 俗名：捻转胃虫，分类地位见附录A。捻转血矛线虫感染 haemonchus contortus infection 可在宿主粪便中检出捻转血矛线虫虫卵或能在宿主真胃内检出捻转血矛线虫成虫，而宿主无明显临床症状和体征。捻转血矛线虫病 haemonchosis contortus 由捻转血矛线虫寄生于宿主真胃或小肠所引起的免疫系统、消化系统和血液系统等病变，并出现相应的临床症状和体征。4 诊断依据 流行病学 宿主生活或来源于捻转血矛线虫病流行区，且有采食被捻转血矛线虫感染性幼虫污染的青草或饲料史。临床表现 4.2.1 急性型 DB15/T 25062022 2 羊只显著贫血，眼睑黏膜苍白，身体逐渐衰弱、消瘦，被毛粗乱，下痢和便秘交替，严重时下颌、下腹部及四肢水肿，短期内引起羔羊死亡。4.2.2 慢性型 羊只被毛粗乱而无光泽、动作迟钝、体形消瘦、发育受阻、生长停滞。实验室检查 4.3.1 血常规检查发现血中红细胞总数降低。4.3.2 粪便虫卵检测按照附录 G 的规定，发现捻转血矛线虫虫卵，其特征描述见附录 C。4.3.3 粪便幼虫培养按照附录 G 的规定，检出捻转血矛线虫感染性幼虫，其特征描述见附录 D。4.3.4 粪便基因组 DNA 通过 PCR 检测按照附录 G 的规定，扩增出捻转血矛线虫特异性条带。4.3.5 真胃内容物淘洗检查按照附录 G 的规定，检出捻转血矛线虫成虫，其特征描述见附录 E。5 检疫鉴定原则 根据流行病学、临床表现，结合 4.3.1、4.3.2、4.3.3 中任两条检查结果可初步诊断。根据 4.3.4 和 4.3.5 中的任一条检查结果可确切诊断。6 诊断 疑似捻转血矛线虫感染 无明显临床症状，同时符合4.1和4.2，且符合4.3.1、4.3.2、4.3.3中任两条。确诊捻转血矛线虫感染 疑似捻转血矛线虫感染，且符合4.3.4和4.3.5中的任一条。7 鉴别诊断 捻转血矛线虫卵与其他胃肠道线虫卵相鉴别见附录 F。捻转血矛线虫感染性幼虫与其他圆线虫感染性幼虫相鉴别见附录 F。DB15/T 25062022 3 A A 附录A （资料性）捻转血矛线虫分类地位 血矛线虫属线虫的系统发育树（Hoberg EP 等,2004）见图A.1。捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）属于动物界（Animalia），线虫纲（Nematoda），圆线目（Strongylida），毛圆科（Trichostrongylidae），血矛属（Haemonchus）。该属共有12种虫体（图1），其中，捻转血矛线虫为该属发现的第一种虫体。*图A.1 血矛线虫属线虫的系统发育树（Hoberg EP 等,2004）DB15/T 25062022 4 B B 附录B （资料性）捻转血矛线虫生活史 捻转血矛线虫生活史见图B.1。捻转血矛线虫整个生活史包括自由生活期和寄生生活期。按照虫卵孵化后的发育结构可划分为五个阶段，即自由生活期的一期幼虫、二期幼虫和三期幼虫三个阶段；寄生生活期的四期幼虫和成虫两个阶段。新排出的虫卵在27 条件下经5 d发育为第三期幼虫，羊通过摄入第三期幼虫而感染,在感染后第15 d性成熟虫体开始交配，第18 d部分雌虫开始产卵。图B.1 捻转血矛线虫生活史 DB15/T 25062022 5 C C 附录C （资料性）捻转血矛线虫虫卵形态 粪便中检出的捻转血矛线虫虫卵（40）见图C.1。捻转血矛线虫新鲜虫卵夹杂在羊粪中排出，为淡灰黑色，椭圆形，平均大小为70.9 m 45.9 m，最小为65.5 m 43.3 m，最大为95.0 m 46.6 m。卵壳质地均匀，厚约1.0 m。随粪便刚排出的卵为桑葚期或更早。图C.1 粪便中检出的捻转血矛线虫虫卵（40）粪便中检出的捻转血矛线虫虫卵（400）见图C.2。图C.2 粪便中检出的捻转血矛线虫虫卵（400）DB15/T 25062022 6 D D 附录D （资料性）捻转血矛线虫感染性三期幼虫形态 捻转血矛线虫感染性三期幼虫形态（40）见图D.1。第三期幼虫，大小约0.650.75 mm 0.0250.030 mm，幼虫口孔封闭，圆形的小口腔开始出现，腔有小管道通于食道的空隙，食道呈丝状形。肠管由16个方形细胞所构成，尾部尖细，长约0.054 mm0.068 mm。图D.1 捻转血矛线虫感染性三期幼虫形态（40）DB15/T 25062022 7 E E 附录E （资料性）捻转血矛线虫成虫形态 捻转血矛线虫形态结构见图E.1。捻转血矛线虫雌雄异体，颈乳突明显。雌虫长1.8 cm3.0 cm；眼观生殖器为白色，消化道为红色，新鲜虫体呈现为红白色相互缠绕状；镜下阴门盖异常明显。雄虫长1.5 cm2.2 cm，背肋作“Y”字形。A 胃黏膜上的捻转血矛线虫成虫 B 胃黏膜上大量的捻转血矛线虫 C 捻转血矛线虫成虫头部（100）D 捻转血矛线虫雌虫尾部（100）E 捻转血矛线虫雌虫阴门盖（100）F 捻转血矛线虫雄虫交合刺（400）图E.1 捻转血矛线虫形态结构 DB15/T 25062022 8 F F 附录F （资料性）鉴别诊断 F.1 羊粪便中常见胃肠道线虫虫卵特征见表 F.1。表F.1 羊粪便中常见胃肠道线虫虫卵特征 虫种名称 虫卵图谱 形态描述 长径(m)辐径(m)捻转血矛线虫 Hcemonchus contortus 虫卵椭圆形，卵壳略带黄色。6695 4346 环纹奥斯特线虫 Ostertagia circumcincta 虫卵椭圆形，系典型的圆线虫类虫卵。8995 4659 叶氏古柏线虫 Cooperia erschovi 虫卵椭圆形。6773 2241 蛇形毛圆线虫 Trichostrongylus colubriformis 虫卵椭圆形。7376 4043 羊仰口线虫 Bunostomum trigonocephalum 虫卵两端钝圆，两侧平直，胚细胞大而数少，内含暗色颗粒。8297 4757 哥伦比亚食道口线虫 Oesophagostomum columbianum 虫卵椭圆形，刚排除时内含卵裂细胞 816 个。6575 4045 DB15/T 25062022 9 表F.1 羊粪便中常见胃肠道线虫虫卵特征（续）虫种名称 虫卵图谱 形态描述 长径(m)辐径(m)绵羊夏伯特线虫 Chabertia ovina 虫卵椭圆形。85130 4256 F.2 捻转血矛线虫感染性幼虫与羊其他圆线虫的感染性幼虫见图 F.1。图F.1 捻转血矛线虫感染性幼虫与羊其他圆线虫的感染性幼虫 DB15/T 25062022 10 G G 附录G （规范性）实验室检查 G.1 粪便虫卵检测 G.1.1 原理 采用饱和盐水漂浮法对粪便样本进行检测，其原理是使用比重高于虫卵的漂浮液，使粪便中的虫卵和粪便渣子分开而浮于液体表面，然后在显微镜下进行观察。G.1.2 实验设备、耗材及试剂 普通光学显微镜、测微尺、天平、烧杯、镊子、量筒、40目筛网、安剖瓶、载玻片、盖玻片、热水壶、食用盐、纯净水。G.1.3 饱和盐水配置方法 取400 g食用盐溶于1000 mL烧开的纯净水中，充分搅拌，待冷却后使用。G.1.4 检查方法 G.1.4.1 样本处理 取新鲜粪便样品2 g于50 mL烧杯中，加少许饱和食盐水用镊子压碎，加饱和食盐水至20 mL，搅拌均匀，用40目筛网过滤，将滤液置于安剖瓶中，使液面略高于瓶口，静置30 min。G.1.4.2 虫卵检测 用盖玻片轻轻蘸取漂浮液液面后，置于载玻片上，通过显微镜观察，同时用测微尺对虫卵长轴和纵轴进行测量，并记录。G.2 捻转血矛线虫感染性幼虫检测 G.2.1 实验设备及耗材 普通光学显微镜、离心机、生化培养箱、搪瓷盘、医用纱布、烧杯、15 mL离心管、载玻片、镊子、吸管、纯净水。G.2.2 检查方法 G.2.2.1 感染性幼虫培养 取待检羊新鲜粪便，置于干净的搪瓷盘中，顶部稍高于搪瓷盘边缘，其上盖3层医用纱布，盖好搪瓷盘盖，置于28 恒温箱中。定时搅拌疏松粪便，并喷洒适量蒸馏水保持湿度。培养7 d后，将医用纱布置于烧杯中用纯净水冲洗，随后弃去医用纱布并将烧杯中液体置于离心管中，4000 r/min离心5 min。G.2.2.2 感染性幼虫检测 将离心管取出，弃上清，吸取沉淀于载玻片上，在普通光学显微镜下观察、鉴定。G.3 普通 PCR 鉴定 DB15/T 25062022 11 G.3.1 实验设备、耗材及试剂 离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、核酸蛋白检测仪、移液器、微波炉、三角瓶、离心管、PCR管、吸头、粪便基因组DNA提取试剂盒、特异性引物、50TAE、琼脂糖、DNA Marker 2000、PCR Mix、无菌无酶水。G.3.2 鉴定方法 G.3.2.1 粪便基因组 DNA 提取 取待检粪便样本，按照粪便基因组DNA提取试剂盒说明书对基因组DNA进行提取。之后，使用核酸蛋白检测仪对提取的DNA浓度进行测定。G.3.2.2 捻转血矛线虫特异性引物鉴定 以所提的DNA样本为模版，使用捻转血矛线虫特异性引物HAE（5-CAAATGGCATTTGTCTTTT AG-3）/NC2（5-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3）进行PCR扩增。PCR反应体系为：25 L体系中加入上下游引物（10 mmol/L）各1 L，2PCR Mix 12.5 L，DNA模版2 L，无菌无酶水8.5 L。PCR扩增条件为：94 预变性5 min；94 变性30 s；55 退火30 s；72 延伸30 s；35个循环；72 总延伸7 min；4 保存。G.3.2.3 结果判定 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以阳性对照组和待检样本扩增出265bp的目标条带，阴性对照组未扩增出条带，判定为捻转血矛线虫感染阳性；阳性样本进一步测序，序列与标准序列一致。捻转血矛线虫标准序列：caaatggcat ttgtctttta gacaattccc atttcagttc aagaacatat acatgcaacg tgatgttatg aaattgtaac attcctgaat gatatgaaca tgttgccact atttgagtgt actcagcgaa tattgagatt gacttagata gtgacttgta tggcgacgat gttcttttat catttgtata atgcaacctg agctcaggcg tgattacccg ctgaacttaa gcatatcatt tagcggagga aaagaaacta a G.4 成虫检查 G.4.1 实验