DB15T 2022-2020 牛和马源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法.pdf

ICS 07.080 CCS A 40 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 20222020 牛和马源性成分同步检测方法 实时荧光 PCR 法 Real-time PCR Method for Authentification of Cattle and Horse Derived Materials 2020-10-20 发布 2020-11-20 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 20222020 I 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由锡林郭勒职业学院、锡林郭勒食品药品检验检测和风险评估中心提出。本文件由内蒙古自治区肉乳标准化技术委员会（SAM/TC 39）归口。本文件起草单位：锡林郭勒职业学院、锡林郭勒食品药品检验检测和风险评估中心。本文件主要起草人：郭梁、罗建兴、徐伟良、其勒木格、郭元晟、李春冬、刘国强。DB15/T 20222020 1 牛和马源性成分同步检测方法 实时荧光 PCR 法 1 范围 本文件描述了动物产品（肉、乳）中牛和马源性成分的实时荧光PCR检测方法。本文件适用于鲜肉、鲜乳、加工肉制品、加工乳制品中牛和马源性成分的定性检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 实时荧光 PCR real time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时检测整个PCR过程，对未知模板进行定性或定量分析。3.2 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。3.3 阳性对照 positive control 用已知含有牛和马源性成分的样品作阳性对照。3.4 阴性对照 negative control 用已知不含有牛和马源性成分的样品作阴性对照。DB15/T 20222020 2 3.5 空白对照 blank control 用等体积的灭菌水代替模板DNA作空白对照。4 原理 利用不同荧光基团标记特异性牛和马探针以及质控探针，采用多重实时荧光PCR技术，对提取于鲜肉、鲜乳、加工肉制品、加工乳制品的DNA进行扩增。在同一反应中对牛和马特异基因以及质控基因同时扩增，三种荧光同时检测。其中，同管质控探针的检测旨在监控扩增反应是否正常进行，避免假阴性结果。通过评价Ct值判断动物产品（肉、乳）是否含有牛和马源性成分。5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水为符合GB/T 6682规定的一级水。5.1 三氯甲烷。5.2 异戊醇。5.3 异丙醇。5.4 95%乙醇。5.5 75%乙醇。5.6 CTAB 提取液：称取 10 g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、40.6 g NaCl、6.06 g Tris base（三羟甲基氨基甲烷）、3.94 g Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠），加入 800 mL 的水，在 65 水浴加热溶解，用 HCl 调节 pH 至 8.0，加水定容至 1000 mL，在 121 条件下，灭菌 30 min。使用前加入终浓度为 2%的 -巯基乙醇。5.7 乳化剂：量取 20 mL Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚，90%）、125 mL 乙醇（95%）、855 mL NaCl 溶液（0.9 g/L），加水定容至 1000 mL，在 121 条件下，灭菌 30 min。5.8 PBS 缓冲液（磷酸缓冲液）：称取 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4，加入 800 mL 水溶解，用 HCl 调节 pH 至 7.4，加水定容至 1000 mL，在 121 条件下，灭菌 30 min。5.9 实时荧光 PCR 反应混合液：1 U2 U 的Taq酶、1PCR 缓冲液、2.5 mmol/L4.0 mmol/L 的Mg2+、0.2 U1 U 的 UNG 酶、0.2 mmol/L 的 dNTP。也可以使用同等效果的商品试剂盒。5.10 牛和马源性成分扩增引物和探针详见表 1。表1 引物和探针序列 名称 序列（5 3）目标基因/大小 正向引物 TTGAATYAGGCCATGAAGC 线粒体 12S rRNA 基因 牛 120 bp 马 121 bp 反向引物 CTTACCTTGTTACGACTTGTCTC 牛特异性探针 FAM-CTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTAAATAGGG-TAMRA DB15/T 20222020 3 表1 引物和探针序列（续）名称 序列（5 3）目标基因/大小 马特异性探针 HEX-TTCATATGTTTGGGTCACGGTTTTATGT-TAMRA 质控探针 ROX-ACACACCGCCCGTCACCCT-BHQ-2 注：用灭菌水分别将上述引物和探针稀释到 10 mol/L，探针需避光保存，序列中 Y 代表 T/C。6 仪器和设备 6.1 实时荧光 PCR 仪：通道数3，温度控制精度0.1。6.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3 离心机：离心力12000 g。6.4 微量移液器：0.5 L10 L，10 L100 L，20 L200 L，100 L1000 L。6.5 金属浴或恒温水浴锅：温度控制精度0.5。6.6 pH 计：0.01 级。6.7 均质器。6.8 搅拌器。6.9 分析天平：感量 0.1 g 和 0.0001 g。6.10 高压灭菌锅。6.11 旋涡混匀器。7 分析步骤 7.1 样品制备 利用均质器将固态样品充分混匀，装入清洁容器中，加封后，注明标记。利用搅拌器将液态样品充分混匀，装入清洁容器中，加封后，注明标记。-20 保存。7.2 DNA 提取 7.2.1 鲜肉及肉乳制品样品（固态）称取100 mg均质固态样品于1.5 mL灭菌离心管中；加入700 L CTAB提取液（5.6），充分混匀，置于65 水浴30 min，期间每隔5 min颠倒混匀一次；13000 rpm离心5 min，转移上清液于新离心管中，加入等体积三氯甲烷和异戊醇混合液（体积比为24:1），旋涡混匀，13000 rpm离心5 min，取上清液于新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，13000 rpm离心5 min，弃去上清液，75%乙醇洗涤两次（13000 rpm离心30 s弃去上清液），室温晾干，加入20 L50 L灭菌水溶解，-20 保存。对阳性对照和阴性对照进行同法操作。用灭菌水代替样品进行核酸抽提作为提取空白对照。也可以使用同等效果的DNA提取试剂盒。DB15/T 20222020 4 7.2.2 鲜乳及乳制品样品（液态）量取50 mL均质液态样品于50 mL灭菌离心管中；在4，7500 rpm条件下，离心30 min，去除离心管上层乳脂和中间层的液体，保留底部沉淀；向离心管中加入600 L PBS缓冲液（5.8），将沉淀悬浮并全部转移至1.5 mL灭菌离心管中，在4，13000 rpm条件下，离心10 min，弃去上层液体，保留底部沉淀；向离心管中加入60 L乳化剂（5.7）和540 L PBS缓冲液（5.8），振荡至沉淀完全悬浮，置于40 恒温水浴10 min，在4，13000 rpm条件下，离心10 min，弃去上清液保留底部沉淀；加入500 L PBS缓冲液（5.8）悬浮沉淀，在4，13000 rpm条件下，离心10 min，弃去上清液保留底部沉淀；后续提取步骤按照7.2.1方法进行。用灭菌水代替样品进行核酸抽提作为提取空白对照。也可以使用同等效果的DNA提取试剂盒。7.2.3 DNA 浓度和纯度的测定 分别检测260 nm和280 nm处的吸光值A260和A280，按公式（1）计算DNA浓度，判定DNA的纯度。当DNA浓度在10 ng/L100 ng/L，A260/A280比值在1.72.1之间时，适合实时荧光PCR反应。若浓度大于100 ng/L时，建议用灭菌水稀释；若浓度小于10 ng/L或比值小于1.7时，建议重新进行DNA提取。c=AN 50/1000 （1）式中：c DNA浓度，单位为微克每微升（g/L）；A 260 nm处的吸光值；N 核酸稀释倍数。7.3 实时荧光 PCR 检测 7.3.1 实时荧光 PCR 反应体系 设置阳性对照、阴性对照、空白对照以及提取空白对照。所有样品设置平行反应。实时荧光PCR反应体系见表 2。表2 实时荧光 PCR 反应体系 单位为微升 试剂 体积 2实时荧光 PCR 反应混合液 10.0 正向引物（10 mol/L）1.0 反向引物（10 mol/L）1.0 牛特异性探针（10 mol/L）0.5 马特异性探针（10 mol/L）0.5 质控探针（10 mol/L）0.5 DNA 模板（10 ng/L100 ng/L）1.0 灭菌水 5.5 总体积 20.0 注：反应体系根据不同厂家的商品试剂盒或不同型号的实时荧光 PCR 仪进行调整。DB15/T 20222020 5 7.3.2 实时荧光 PCR 反应程序 预变性：94 30 s，1个循环；94 5 s，60 31 s，40个循环，在60 时收集荧光信号。反应程序根据不同厂家的商品试剂盒或不同型号的实时荧光PCR仪进行调整。8 质量控制 以下条件有一条不满足时，试验视为无效：a)空白对照：所有探针无荧光对数增长或 Ct 值40.0；b)阴性对照：特异性探针无荧光对数增长或 Ct 值40.0；质控探针有荧光对数增长，Ct 值30.0；c)阳性对照：特异性探针和质控探针均有荧光对数增长，且出现典型的扩增曲线，Ct值30.0；d)平行反应结果不一致，需要重新扩增。9 结果判定与表述 9.1 结果判定 在符合第8章的情况下：a)特异性探针 Ct 值35.0 且质控探针 Ct 值35.0，则判定为阳性；b)特异性探针 Ct 值40.0 且质控探针 Ct 值35.0，则判定为阴性；c)特异性探针 35.0Ct 值40.0 且质控探针 Ct 值35.0，则需要重复实验；如再次扩增后特异性探针 Ct 值仍40.0，则判定为阳性；如再次扩增后特异性探针 Ct 值40.0，则判定为阴性。9.2 结果表述 9.2.1 样品阳性，表述为“检出牛或/和马源性成分”。9.2.2 样品阴性，表述为“未检出牛或/和马源性成分”。10 检测过程中防止交叉污染的措施 按照GB/T 27403中附录D的规定执行。DB15/T 20222020 6 A A 附 录 A（资料性）目的基因扩增靶标参考序列 A.1 牛特异性基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列（120 bp）及引物和探针位置 TTGAATTAGGCCATGAAGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCTAACCCTATTTAAACGCACTAGCTACATGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAG 注：单下划线部分为正向引物和反向引物序列，双下划线部分为质控探针序列，虚线部分为牛特异性探针序列。A.2 马特异性基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列（121 bp）及引物和探针位置 TTGAATCAGGCCATGAAGCGCGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTTAAATATCACAAATCACAACATAACATAAAACCGTGACCCAAACATATGAAAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAG 注：单下划线部分为正向引物和反向引物序列，双下划线部分为质控探针序列，虚线部分为马特异性探针序列。