DB15T 1594-2019 青贮饲料中微生物数量测定方法.pdf

ICS 65.120 B 46 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 15942019 青贮饲料中微生物数量测定方法 Code for measuring microorganism counts in silage 2019-02-20 发布 2019-05-20 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 15942019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 方法.2 5 仪器设备.2 6 培养基和试剂.2 7 测定程序.3 8 分析步骤.3 9 微生物数量计算.3 附录 A（资料性附录）培养基.4 DB15/T 15942019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古农业大学、中国农业科学院草原研究所、沈阳农业大学、内蒙古草都饲草料研究院、内蒙古自治区草原勘察规划院。本标准主要起草人：孙林、薛艳林、格根图、张福金、殷国梅、孙杰、赵和平、孙娟娟、白春生、王志军、羿静、张欣昕、刘广华、范文强、张园园、刘思博、张琼琳。DB15/T 15942019 1 青贮饲料中微生物数量测定方法 1 范围 本标准规定了青贮饲料中乳酸菌、大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌数量测定的方法、仪器设备、培养基和试剂、测定程序、分析步骤、数量计算。本标准适用于内蒙古地区青贮饲料中微生物数量测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3 术语和定义 3.1 青贮饲料微生物 microorganism in silage 青贮饲料中的乳酸菌、大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌等微生物。3.2 乳酸菌数量 lactic acid bacteria count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得 1 g 试样中所含乳酸菌数量。3.3 大肠杆菌数量 coliform bacteria count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得1 g试样中所含大肠杆菌的数量。3.4 细菌数量 bacteria count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得1 g试样中所含好氧细菌数量。DB15/T 15942019 2 3.5 霉菌数量 moulds count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得1 g试样中含霉菌数量。3.6 酵母菌数量 yeasts count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得1 g试样中含酵母菌数量。3.7 菌落形成单位 colony-forming units，CFU 在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算微生物数量的单位。4 方法 根据青贮饲料中微生物生理特性，选择分别适宜于真菌、细菌、大肠杆菌和乳酸菌生长的培养基，采用平板计数方法，测定微生物数量。5 仪器设备 5.1 分析天平，感量 0.001 g。5.2 恒温培养箱：36 1。5.3 高压灭菌器：灭菌压力 0-3 kg/cm2。5.4 振荡器：往复式。5.5 涡旋震荡器：2900 r/min。5.6 灭菌玻璃三角瓶：250 mL，500 mL。5.7 灭菌试管：15 mm150 mm。5.8 灭菌培养皿：直径 90 mm。5.9 灭菌吸管：1 mL，10 mL。5.10 灭菌玻璃珠：直径 5 mm。5.11 水浴锅：（4577）1。5.12 超净工作台。6 培养基和试剂 6.1 乳酸菌培养基：MRS 琼脂，见附件 A.1。6.2 大肠杆菌培养基：结晶紫中性红胆盐琼脂，见附件 A.2。6.3 细菌培养基：营养琼脂，见附件 A.3。6.4 霉菌培养基：马铃薯葡萄糖琼脂，见附件 A.4。6.5 酵母菌培养基：马铃薯葡萄糖琼脂，见附件 A.4。6.6 稀释液：称取氯化钠 8.5 g，溶于 1000 mL 蒸馏水中，分装后，121 高压灭菌 30 min。6.7 除特殊注明，所用试剂均为分析纯；水符合 GB/T 6682 三级水规格。DB15/T 15942019 3 6.8 实验室常用消毒试剂。7 测定程序 青贮饲料微生物数量测定程序图见图1。图1 青贮饲料微生物数量测定程序图 8 分析步骤 8.1 按照 GB/T 14699.1 中的规定执行，采样时注意样品的代表性和避免污染。8.2 菌液制备 以无菌操作称取 25 g 青贮样品放入装有 225 mL 灭菌稀释液的玻璃三角瓶中，封口后置振荡器上，振荡 30 min，即为 1:10 的菌液。8.3 用灭菌吸管吸取 1:10 菌液 10 mL，注入灭菌试管中，置涡旋震荡器上混合 3 min，使微生物充分分散成单个细胞。8.4 用灭菌吸管吸取 8.3 的菌液（1:10）1 mL，注入含有 9 mL 灭菌稀释液试管中，置涡旋震荡器上混合 1 min，此液为 1:100 菌液。8.5 按照上述操作顺序作 10 倍递增稀释，每稀释一次，换用一支 1mL 灭菌吸管；根据对样品情况的估计，选择三个合适稀释度；吸取 1 mL 所选稀释度菌液于灭菌培养皿中，每个稀释度作两个培养皿。8.6 菌液移入培养皿后，应及时将至 45 至 60 的培养基注入培养皿约 15 mL 并转动培养皿使混合均匀。8.7 待培养基凝固后，翻转培养皿，倒置于恒温（乳酸菌：30 厌氧，大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌：30）培养箱中，培养 24 h 至 96 h（乳酸菌：72 h，霉菌和酵母菌：96 h，大肠杆菌：24 h，细菌：96 h）后开始观测计数。8.8 选取乳酸菌、大肠杆菌、细菌或酵母菌等菌落数在 30 CFU300 CFU 之间的培养皿进行计数，选取霉菌菌落数在 10 CFU100 CFU 之间的培养皿进行计数；每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。9 微生物数量计算 青贮饲料中乳酸菌、大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌数量按公式（1）计算：N=(C 10 n-1 250)/25（1）式中:N每克青贮饲料中微生物数量，单位为CFU/g；C相同稀释度两个培养皿上菌落数的平均值；n稀释度。DB15/T 15942019 4 A A 附 录 A（资料性附录）培养基 A.1 MRS琼脂 A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 5.0 g 酵母粉 4.0 g 葡萄糖 20.0 g 吐温80 1.0 mL K2HPO47H2O 2.0 g 醋酸钠3H2O 5.0 g 柠檬酸三铵 2.0 g MgSO47H2O 0.2 g MnSO44H2O 0.05 g 琼脂粉 15.0 g A.1.2 制法 将上述成分加入到1000 mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH至6.20.2，分装后121 高压灭菌15 min。A.2 结晶紫中性红胆盐琼脂 A.2.1 成分 蛋白胨 7.0 g 酵母膏粉 3.0 g 乳糖 10.0 g 氯化钠 5.0 g 3号胆盐 1.5 g 中性红 0.03 g 结晶紫 0.002 g 琼脂 15.0 g A.2.2 制法 将上述成分加入到1000 mL蒸馏水中，煮沸不要超过2 min，调节pH至pH 7.40.2。DB15/T 15942019 5 A.3 营养琼脂 A.3.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 3.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g A.3.2 制法 将上述成分加入到1000 mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH至7.3 0.1，分装后121 高压灭菌15 min。A.4 马铃薯葡萄糖琼脂 A.4.1 成分 马铃薯 200.0 g 葡萄糖 20.0 g 琼脂 20.0 g A.4.2 制法 将上述成分加入到1000 mL蒸馏水中，加热溶解，分装后121 高压灭菌15 min。_