DB15T 2323-2021 燕麦籽粒及其制品中β-葡聚糖含量测定.pdf

ICS 67.060 CCS B22 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 23232021 燕麦籽粒及其制品中-葡聚糖含量测定 Determination of-Glucan in Oat Grains and Products 2021-08-20 发布 2021-09-20 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 23232021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古自治区植保植检站、呼和浩特市种子管理站。本文件主要起草人：韩冰、南金生、王跃飞、安江红、赵鸿彬、杨燕、刘慧艳、张文静、李庆华、王鑫、陈友君。DB15/T 23232021 1 燕麦籽粒及其制品中-葡聚糖含量测定 1 范围 本文件规定了燕麦籽粒及其制品中-葡聚糖含量的测定方法。本文件适用于燕麦籽粒及其制品面粉、麸皮、麦片、饮品、发酵制品中-葡聚糖含量的测定，定量检测的检出限为0.0112 g/g。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 5009.3 食品安全国家标准 食品中水分的测定 GB/T 6682 分析实验室用水规格及试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 方法和原理 用地衣聚糖酶将样品中的-葡聚糖分子水解成寡糖，-葡萄糖苷酶将寡糖水解成葡萄糖，GOPOD试剂中的葡萄糖氧化酶使葡萄糖分解成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶作用下能够与4-氨基安替比林生成红色醌类化合物，在510 nm处其吸光值与葡萄糖含量成正比，通过计算葡萄糖含量从而得到样品中-葡聚糖含量。5 试剂 5.1 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水。5.2 氢氧化钠（NaOH）。5.3 磷酸二氢钠（NaH2PO4）。5.4 叠氮化钠（NaN3）。5.5 无水乙醇（C2H6O）。5.6 冰醋酸（CH3COOH）。5.7 对羟基苯甲酸（C7H6O3）：纯度大于等于 98%。DB15/T 23232021 2 5.8 地衣聚糖酶（活力大于 1000 U/mL）：特异性的内切-(1-3)(1-4)-D-葡聚糖 4-葡聚糖水解酶。5.9-葡萄糖苷酶（活力大于 40 U/mL）：以对硝基苯基-葡萄糖苷为底物进行标准化。5.10 葡萄糖氧化酶：纯度 99.99%。5.11 过氧化物酶：纯度 99.99%。5.12 4-氨基安替比林（C11H13N3O）：纯度大于等于 98%。5.13 GOPOD 试剂酶：将 12000 U 葡萄糖氧化酶、650 U 过氧化物酶和 80 mg 4-氨基安替比林混合。5.14 氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取 4.00 g 氢氧化钠（5.2）于烧杯中，加入少量水溶解，待冷却至室温，用容量瓶定容至 100 mL。5.15 氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）：称取 4.00 g 氢氧化钠（5.2）粉末于烧杯中，加入少量水溶解，待冷却至室温，用容量瓶定容至 1000 mL。5.16 乙醇溶液（50%，V/V）：取一定量无水乙醇（5.5）加入到等体积水中，充分混匀。5.17 磷酸钠缓冲液（0.02 mol/L）：称取 3.12 g 磷酸二氢钠（5.3）溶于 900 mL 水中，用 0.1 mol/L氢氧化钠溶液（5.15）调节 pH 值为 6.5，用容量瓶将体积定容至 1000 mL，再加入 0.2 g 叠氮化钠。4 保存，稳定性 2 个月。5.18 醋酸钠缓冲液（0.05 mol/L）：量取 2.90 mL 冰醋酸（5.6）至 900 mL 水中，用 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液（5.15）调节 pH 值为 4.0，用容量瓶将体积定容至 1000 mL，加入 0.2 g 叠氮化钠。4 保存，稳定性 2 个月。5.19 醋酸钠缓冲液（0.2 mol/L）：量取 11.60 mL 冰醋酸（5.6）至 900 mL 水中，用 1 mol/L 氢氧化钠溶液（5.14）调节 pH 值为 4.0，用容量瓶将体积定容至 1000 mL，加入 0.2 g 叠氮化钠。4 保存，稳定性 2 个月。5.20 地衣聚糖酶溶液（50 U/mL）：将 1 mL 地衣聚糖酶（5.8）用 0.02 mol/L 磷酸钠缓冲液（5.17）稀释至 20.0 mL。现用现配。5.21-葡萄糖苷酶溶液（2 U/mL）：将 1 mL-葡萄糖苷酶（5.9）用 0.05 mol/L 醋酸钠缓冲液(5.18)稀释至 20.0 mL。现用现配。5.22 GOPOD 缓冲液（0.095%，W/V）：取 0.95 mg 对羟基苯甲酸（5.7），用 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液（5.15）调节 pH 值为 7.4，用容量瓶将体积定容至 1000 mL，加入 0.2 g 叠氮化钠。4保存，稳定性 4 年。5.23 GOPOD 酶液：将 50.0 mL GOPOD 缓冲液（5.22）用水稀释至 1 L，取 20.0 mL 稀释后的 GOPOD 缓冲液溶解 GOPOD 试剂酶，向溶解后的酶液加入剩余的 GOPOD 缓冲液，该溶液即为葡萄糖测定试剂，新鲜配制的酶液为淡黄色或淡粉色，相对于水，该酶液的吸光值应小于 0.05。现用现配。5.24 D-葡萄糖标准品：纯度大于等于 98%，CAS 号为 50-99-7。5.25 D-葡萄糖标准液（1.0 mg/mL）：精确称取 0.05 g D-葡萄糖（5.24），溶于水中，并移入 50 mL容量瓶中，稀释至刻度线，混匀，-20 保存。DB15/T 23232021 3 5.26-葡聚糖标准品：含量 7.5%（干重）。6 仪器和设备 6.1 分光光度计：波长范围 380 nm780 nm；配 10 mm 比色皿。6.2 破壁粉碎机：配 0.5 mm 筛网。6.3 pH 计：精度 0.01。6.4 分析天平：感量 0.0001 g。6.5 水浴锅：温度稳定性0.2。6.6 离心机：转速大于等于 6000 rpm。6.7 涡漩混合仪。7 样品制备 7.1 颗粒或片状样品 称取50 g以上待测样品，用破壁粉碎机进行粉碎，粉碎后全部通过0.5 mm直径的筛网，将所获粉末置于广口瓶中密封保存。7.2 粉末状样品 称取50 g以上待测样品，置于广口瓶中密封保存。7.3 液体样品 混匀后量取200 mL以上待测样品，置于广口瓶密封保存。7.4 含颗粒状液体样品 混匀后量取200 mL以上待测样品，置于广口瓶密封保存。8 检测方法 8.1 酶解前处理 对固体、液体和含颗粒状液体样品分别进行酶解前处理：固体样品。称取待测粉末样品 80 mg100 mg（精确到 0.1 mg），置于 15 mL 干净离心管中，加入 0.2 mL 50%乙醇溶液（5.16）使样品湿润以利于分散。在离心管中加入 4.0 mL 0.02 mol/L磷酸钠缓冲液（5.17），用漩涡混合仪将内容物振荡均匀。将离心管置于沸水浴 1 min，取出后用漩涡混合仪剧烈振荡数秒，然后再次置于沸水浴 2 min，取出后剧烈振荡数秒。液体样品。量取 3.00 mL（精确到 0.01 mL）样品置于干净离心管。DB15/T 23232021 4 含颗粒状液体样品。精确称量干燥玻璃试管重量，取待测样品 3.00 mL（精确到 0.01 mL）置于试管底部，沸水浴 5 min，室温静置。将试管中加入 3.0 mL 无水乙醇（5.5）混合内容物，再加入 5.0 mL 无水乙醇（5.5）剧烈振荡，室温下 3000 rpm 离心 10 min，去上清液。将试管中加入 8.0 mL 50%乙醇溶液（5.16），在漩涡混合仪上将沉淀再次分散，然后 1600 rpm离心 10 min，去上清液，含沉淀的试管称重，按照 GB 5009.3 进行烘干，获得沉淀的含水量，干物质用于酶解反应。将试管中加入 0.02 mol/L 磷酸钠缓冲液（5.17），调节容积至 4.0 mL，用漩涡混合仪将内容物振荡均匀。8.2 酶解反应 将离心管置于50 水浴5 min，加入0.2 mL地衣聚糖酶（5.20），剧烈振荡内容物数秒，加盖，50 水浴60 min，期间用漩涡混合仪振荡34次，每次数秒。在离心管中加入5.0 mL 0.2 mol/L醋酸钠缓冲液（5.19），用漩涡混合仪剧烈振荡。将离心管在室温下静置5 min，然后1600 rpm离心10 min，取上清液备用。分别取0.1 mL上清液加入到3支试管（12 mL容量）底部，将其中两支试管加入0.1 mL-葡萄糖苷酶溶液（5.21），剩余一支试管（反应空白）中加入0.1 mL 0.05 mol/L醋酸钠缓冲液（5.18），将所有试管置于50 水浴20 min。8.3 D-葡萄糖标准液处理 取3支试管分别加入0.10 mL D-葡萄糖标准液（5.25）和0.10 mL0.05 mol/L醋酸钠缓冲液（5.18），置于50 水浴10 min，其空白用0.10 mL水代替D-葡萄糖标准液，再加0.10 mL 0.05 mol/L醋酸钠缓冲液（5.18），置于50 水浴10 min。8.4-葡聚糖标准品处理 取80 mg100 mg已知-葡聚糖含量的样品（精确到0.1 mg），处理方法同待测样品（8.1-8.2）。8.5 显色反应 取出上述8.2-8.4中各处理试管，分别向各支试管中加入3.0 mL GOPOD酶液（5.23）置于50 水浴15 min。取出试管，进行吸光值测定（60 min内测完）。8.6 吸光值测定 分别测定D-葡萄糖标准液、标准品处理液和样品的吸光值:D-葡萄糖标准液测定。在工作样池内放入 D-葡萄糖标准液（5.25），510 nm 处测定吸光值为10.2（检验分光光度计和所配制的 GOPOD 酶液是否准确有效）。标准品处理液测定。在工作样池内放入-葡聚糖标准品的处理液，510 nm 处测定吸光值，经计算后与所给含量比较（检验所配制的试剂和所用仪器是否准确有效）。样品测定。依次在工作样池内放入反应空白和待测样品，510 nm 处测定吸光值。如果样品中-葡聚糖含量的浓度大于 10%，将产生比 100g 葡萄糖标准液高的吸光度，此刻应在步骤8.1 之后取适量 0.05 mol/L 醋酸钠缓冲液（5.18）稀释上清液，然后继续步骤 8.2 的步骤，结果计算时应考虑稀释因子 D。平行测定。每个样品进行 3 次平行测定。9 结果结算 DB15/T 23232021 5 9.1 固体样品 固体样品-葡聚糖含量（%w/w，湿基）应按式（1）计算：-葡聚糖含量（%w/w，湿基）=AF9411000100W162180D（1）式中：A 样品吸光值与反应空白吸光值的差值；FF=100D葡萄糖标准品处理液吸光值；94 体积校正因子（从 9.4 mL 取 0.1 mL 用于分析）；W 所分析样品的重量，单位为毫克（mg）；162 180游离葡萄糖转化为脱水葡萄糖的因子；D稀释因子，如没有稀释则为“1”。9.2 液体样品 液体样品-葡聚糖含量（g/100 mL）应按式（2）计算：-葡聚糖含量（g/100 mL）=AF9.23.010001100011000162180D（2）式中：9.23.0体积校正因子（3.0 mL样品经处理，体积调整为9.2 mL，即4.0 mL+0.2 mL地衣酶+5.0 mL醋酸钠缓冲液）。9.3 含颗粒状液体样品 含颗粒状液体样品-葡聚糖含量（%w/v）应按式（3）计算：-葡聚糖含量（%w/v）=AFC1V1001100011000162180D（3）式中：C体积校正因子（参与酶解的干物质含水量 mL 除以用于分析的 0.1 mL）；V液体样品体积，单位为