DB15T 2044-2020 农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程.pdf

ICS 65.020.20 CCS B 05 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 20442020 农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程 Technical code of practice for Agrobacterium-mediated Sugarbeet Genetic Transformation 2020-12-24 发布 2020-01-24 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 20442020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会(SAM/TC 20)归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。本文件主要起草人：张自强、白晨、李晓东、张惠忠、王良、韩平安、张必周、付增娟、赵尚敏、鄂圆圆、郑文哲、张辉。DB15/T 20442020 1 农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程 1 范围 本文件确立了培养基、灭菌、无菌苗培养、侵染液制备与叶片-叶柄预培养、遗传转化、生根培养、移栽和目的基因检测等技术要求。本文件适用于农杆菌介导甜菜遗传转化技术操作的全过程。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 种球 bulb 甜菜的果实。3.2 植物遗传转化 plant genetic transformation 将外源基因转移到植物体内并稳定整合、表达和遗传，从而使受体植物体现转移基因的特征的过程。3.3 农杆菌侵染 infection 农杆菌侵入并感染甜菜外植体的过程。3.4 叶片-叶柄 leaf-petiole 甜菜无菌苗叶片和叶柄相连接的部位，长约 1 cm。4 培养基 4.1 琼脂粉培养基 用于甜菜种球的萌发。成分为（1 L）：琼脂粉7.5 g，pH=5.8。DB15/T 20442020 2 4.2 诱导分化培养基 用于甜菜无菌苗诱导分化培养和甜菜叶片-叶柄的预培养。成分为（1 L）：MS培养基4.74 g，蔗糖30 g，NAA（萘乙酸）0.7 mg，KT（激动素）1.2 mg，琼脂粉7 g，pH=5.8。4.3 生根培养基 用于甜菜无菌苗的生根培养。成分为（1 L）：MS培养基4.74 g，蔗糖30 g，NAA 1.2 mg，琼脂粉7.5 g，草甘膦0.08 M，pH=5.8。4.4 YEP 培养基 用于工程农杆菌的增值培养。成分为（1 L）：牛肉浸膏5 g，酵母提取物10 g，氯化钠5 g，琼脂粉15 g，rif（利福平）50 mg，kan（卡娜霉素）50 mg，pH=7.0。4.5 侵染液培养基 用于加入农杆菌菌液配制侵染液。成分为（1 L）：MS 培养基 4.74 g，蔗糖 30 g，NAA 0.7 mg，KT 1.2 mg，AS(乙酰丁香酮)150 M，pH=6.8。4.6 共培养培养基.用于侵染后甜菜叶片-叶柄与农杆菌的共培养。成分为（1 L）：MS培养基4.74 g，蔗糖30 g，琼脂粉7.5 g，AS 150 M，NAA 0.7 mg，KT 1.2 mg，pH=5.8。4.7 脱菌培养基 用于共培养后的脱菌。成分为（1 L）：MS培养基 4.74 g，蔗糖30 g，琼脂粉7.5 g，cef（头孢霉素）500 mg，kan 50 mg，pH=5.8。4.8 筛选培养基 用于甜菜转化后的筛选培养。成分为（1 L）：MS培养基4.74 g，蔗糖30 g，琼脂粉7.5 g，草甘膦0.08 M，pH=5.8。5 灭菌 5.1 灭菌前准备 制备75%酒精、0.1%升汞、无菌水。5.2 种球灭菌 将甜菜种球磨光，用百菌清（烟剂型）密闭熏蒸24 h后，在超净工作台中移至灭过菌的三角瓶中，随后用75%酒精消毒2 min，无菌水漂洗3 次，接着用0.1%的升汞处理20 min，无菌水漂洗3 次，最后将消毒后的种子接种于琼脂粉培养基上，每三角瓶（100 ml）25粒。6 无菌苗培养 6.1 种球萌发 DB15/T 20442020 3 将接种后的培养瓶置于组培室，23 条件下进行培养，7 d10 d即可萌发。待芽长2.0 cm2.5 cm左右时，带子叶一起切下，接种到新的继代培养基中。培养环境：温度23，光照强度3000 Lux，光照时间14 h。培养20 d25 d成苗。6.2 诱导分化培养 在超净工作台上，将无菌苗置于无菌培养皿中，用灭菌后的手术刀将无菌苗的叶片-叶柄切下，长度为0.8 cm1.2 cm的小段，随后将叶片-叶柄接种于诱导分化培养基中进行分化诱导培养。培养环境：温度23，光照强度3000 Lux，光照时长为14 h。培养时间2 d6 d。7 侵染液制备与叶片-叶柄预培养 7.1 菌液活化 超低温冰箱中取出冷冻含有目的基因的农杆菌EHA105 C58（rif R）Ti pEHA105（pTiBo542DT-DNA）（strep R）Succinamopne）菌液，将菌液在YEP培养平板中划线培养，培养温度28，培养时间14 h。7.2 制备侵染液 将培养好的农杆菌取单菌落并扩繁，收集扩繁后菌体并放置侵染液培养基中重新悬浮，使其OD600值在0.300.50之间，然后冰浴1 h，备用。8 遗传转化 8.1 叶片-叶柄预处理 诱导分化培养后的叶片-叶柄，沿其茎走向用手术刀划出伤口，伤口的深度以不切透叶片-叶柄为准。8.2 农杆菌侵染 将预处理后的叶片-叶柄放入侵染液中，使用真空泵抽真空，使叶片-叶柄完全浸入侵染液，侵染20 min30 min。8.3 共培养 从侵染液中取出叶片-叶柄，置于无菌滤纸上吸干表面残留的侵染液，放入共培养培养基中，进行共培养。培养环境：温度23，暗培养。培养时间3 d6 d。8.4 脱菌培养 共培养后，将叶片-叶柄放入脱菌培养基中，进行脱菌。培养环境：摇床转速125 rpm，温度25，光照强度3000 Lux，光照时间14 h。脱菌2 d3 d。8.5 筛选培养 脱菌培养后，从脱菌培养基中取出叶片-叶柄，放入筛选培养基中，置于培养室培养。培养环境：温度25，光照强度3000 Lux，光照时间14 h。培养15 d20 d，进一步培养成转基因甜菜无菌苗。9 生根培养 DB15/T 20442020 4 从筛选培养基中取出抗性芽，切成1 cm2 cm的单芽，接种到生根培养基中，培养环境：温度25，光照强度3000 Lux，光照时间14 h。20 d30 d即可诱导出新生根。10 移栽 10.1 炼苗 去掉封口膜，在组培室锻炼2 d3 d。10.2 室内移栽 选择根系生长健壮的组培苗从三角瓶中移出，用自来水浸泡根部12 h，洗净根部残留培养基，移栽到花盆中（育苗土由蛭石和田园土构成，二者比例为1:1），并遮阳，定期浇水，室内培养7 d14 d。10.3 大田移栽 待盆栽幼苗生长至 4-6 片真叶时，平均气温稳定在 10 以上时，选择早上或者傍晚移入大田。11 目的基因检测 11.1 PCR 扩增检测 在组培苗进行筛选培养期间，提取组培苗基因组DNA，对目的基因进行PCR扩增，扩增结果有目的基因条带的说明目的基因转入组培苗并成功表达，没有目的基因条带的说明目的基因没有转入组培苗。11.2 涂抹草甘膦检测 使用浓度为 1.4 ml/L（大田除草使用浓度）的草甘膦溶液涂抹甜菜叶片，10 d后对照非转基因甜菜的老叶出现退绿、新叶萎缩畸形等药害反应。而转基因甜菜植株仅有个别新生叶片出现轻度萎缩的轻微药害，但仍保持正常生长活性。说明目的基因转入甜菜再生植株并成功表达。