DB44T 2336-2021 实验动物 病毒PCR定性分析.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 44 44 广东省地方标准 DB44/T 23362021 实验动物 病毒 PCR 定性分析 Laboratory animal Qualitative analysis of virus with polymerase chain reaction method 2021-10-18 发布 2022-01-18 实施 广东省市场监督管理局 发 布 DB44/T 23362021 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.2 5 原理.2 6 主要设备和材料.2 7 试剂.3 8 方法.3 9 结果.10 10 防止交叉污染的措施.11 附录 A（规范性）溶液的配制.12 附录 B（规范性）引物及探针序列.14 参考文献.18 DB44/T 23362021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广东省科学技术厅提出并组织实施。本文件由广东省实验动物标准化技术委员会（GD/TC 93）归口。本文件起草单位：广东省实验动物监测所。本文件主要起草人：王静、袁文、闵凡贵、潘金春、黄树武、罗银珠、何丽芳、张钰、黄韧。DB44/T 23362021 1 实验动物 病毒 PCR 定性分析 1 范围 本文件规定了实验动物病毒的PCR定性分析方法。本文件适用于实验动物相关病毒核酸的定性分析。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。聚合酶链式反应 polymerase chain reaction，PCR 体外酶催化合成特异DNA片段的方法，模板DNA先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种dNTP为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。逆转录-聚合酶链式反应 reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR 以RNA为模板，采用Oligo（dT）、随机引物或特异性引物，RNA在逆转录酶和适宜反应条件下，被逆转录成cDNA，然后再以cDNA作为模板，进行PCR扩增。巢式 PCR nested polymerase chain reaction 巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性DNA片段。第一对PCR引物扩增片段和普通 PCR相似。第二对引物以第一轮PCR产物为模板，特异性地扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段，从而大大提高了反应的敏感性和特异性。实时荧光聚合酶链式反应 real-time PCR，实时荧光 PCR 实时荧光PCR方法是在普通PCR的基础上，在反应体系中加入特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时报告整个PCR进程，通过读取每次循环反应中的荧光发射信号，间接反映了PCR扩增的目标基因的量，最后通过扩增曲线对未知模板进行定性或定量分析。DB44/T 23362021 2 实时荧光逆转录-聚合酶链式反应 real-time RT-PCR，实时荧光 RT-PCR 实时荧光RT-PCR方法是在RT-PCR的基础上，在反应体系中加入特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时报告整个PCR进程，通过读取每次循环反应中的荧光发射信号，间接反映了PCR扩增的目标基因的量，最后通过扩增曲线对未知模板进行定性或定量分析。Ct 值 cycle threshold 实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。cDNA 互补 DNA（complementary DNA）CPE 细胞病变效应（cytopathic effect）DEPC 焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate）DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）EDTA 乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid）PBS 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline）RNA 核糖核酸（ribonucleic acid）TAE 三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液（tris-acetate EDTA）5 原理 用合适的方法提取样本中的总RNA或/和DNA，分别针对病毒保守基因设计特异的引物探针序列，通过普通PCR或实时荧光PCR反应对模板进行扩增，根据PCR反应结果分析该样品中是否含有某种病毒。6 主要设备和材料 PCR 仪。实时荧光 PCR 仪。电泳仪。凝胶成像分析系统。高速冷冻离心机。普通离心机。恒温孵育器。漩涡振荡器。组织匀浆器。微量核酸定量仪。生物安全柜。PCR 超净工作台。冰箱（-20、-80）。DB44/T 23362021 3 微量移液器：0.1 L2 L，1 L10 L，10 L100 L，100 L1000 L。灭菌离心管（1.5 mL、2 mL、5 mL、15 mL），灭菌吸头（10 L，200 L，1 mL），灭菌 PCR 扩增反应管（0.2 mL，八连管或 96 孔板）。采样工具：剪刀、镊子和灭菌棉拭子等。7 试剂 以下所用的试剂除特别注明者外均为分析纯，实验用水为双蒸水或去离子水，应符合 GB/T 6682 所规定一级水的要求。所有涉及分子生物学操作的水均为无 DNA 酶、无 RNA 酶水。灭菌 PBS。配制方法见附录 A。PCR 用水：经 DEPC 处理的水或商品无 DNA 酶、无 RNA 酶水，配制方法见附录 A。RNA 抽提试剂：TRIzol 或其他类似产品。DNA 抽提试剂：基因组 DNA 提取试剂盒 DNeasy Blood&Tissue Kit 或其他类似产品。注：DNA提取试剂盒是由Qiagen公司提供的DNeasy Blood&Tissue Kit。给出这一信息是为了方便本文件使用者，并不表示对这一产品的认可。亦可使用其他类似的DNA提取试剂盒进行。无水乙醇。75%乙醇：使用 DNA 酶、无 RNA 酶水配制为 75%乙醇。三氯甲烷（氯仿）。异丙醇。PCR 试剂：Premix TaqTM（Version 2.0 plus dye）、Premix Ex Taq（Probe qPCR）、One Step PrimerscriptTM RT-PCR Kit（Perfect Realtime）或其他类似产品。注：以上PCR试剂是是由Takara公司提供的商品试剂盒，是本文件适合的市售产品的使用实例，给出这一信息是为了方便本文件使用者，并不表示对这一产品的认可。亦可使用其他类似的PCR试剂。DNA 相对分子质量标准：100 bp2000 bp。50TAE 电泳缓冲液，配制方法见附录 A。溴化乙锭：10 mg/mL，配制方法见附录 A 或其他类似产品。1.5%琼脂糖凝胶，配制方法见附录 A。引物和探针：引物和探针序列见附录 B。根据附录 B 中表 B.1 和表 B.2 序列合成引物和探针，引物和探针加入无 DNA 酶、无 RNA 酶水配制成 10 mol/L 储备液，-20 保存。8 方法 生物安全措施 对于可能潜在人兽共患病的样本，应在生物安全二级及以上实验室进行操作，采样应在生物安全柜中进行。实验操作及处理按照GB 19489的规定，由具备相关资质的工作人员进行相应操作。采样及样本的处理 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样本前处理过程中须戴一次性手套。采样及样本处理过程操作人员应做好个人防护。8.2.1 脏器组织 DB44/T 23362021 4 剖检，无菌采集动物脏器，剪取待检样本0.5 g2 g，加入5倍体积灭菌PBS，使用匀浆器充分匀浆1 min2 min，然后将组织悬液在4，8 000 g离心10 min，取上清液转入另一无菌5 mL离心管中，编号备用。8.2.2 盲肠内容物或粪便 无菌采集动物盲肠内容物或粪便，取待检样本1 g2.0 g于无菌5 mL离心管，加入5倍体积灭菌PBS，使用匀浆器充分匀浆1 min2 min，8 000 g离心5 min，上清液转入另一无菌5 mL离心管中，编号备用。8.2.3 血液样本 无菌采集动物血液0.2 mL0.5 mL，加入柠檬酸钠或EDTA抗凝管中，轻轻颠倒混匀3次5次，编号备用。8.2.4 拭子取样 对活体动物取样可采集肛拭子、口腔拭子、鼻拭子，皮肤拭子、泄殖腔拭子等，浸泡于3 mL无菌PBS中5 min10 min，充分混匀后，4，8 000 g离心5 min，取离心上清液转入另一无菌5 mL离心管中，编号备用。8.2.5 细胞培养物 应通过以下任一方法取样：直接刮取样本接种后出现 CPE 或可疑的细胞培养物置于无菌 15 mL 离心管中，1 500 g离心5 min，弃上清，加 1 mL 灭菌 PBS 重悬细胞，将细胞悬液转移到无菌 1.5 mL 离心管，编号备用；将样本接种后出现 CPE 或可疑的细胞培养物反复冻融三次，细胞混悬液转移于无菌离心管中，8 000 g离心 5 min，弃细胞碎片，上清液转移到无菌 15 mL 离心管中，编号备用。8.2.6 饲料、垫料和饮水 饲料、垫料：取约5 g10 g饲料和垫料置于50 mL无菌离心管中，加入3倍体积灭菌PBS（饲料和垫料需全部浸泡于液体中）。密封后浸泡5 min10 min，充分混匀，将混悬液转移至15 mL无菌离心管，4，8 000 g离心5 min，取上清液转入另一无菌5 mL离心管中，编号备用。饮水：取200 L1000 L实验动物饮水直接转移到无菌1.5 mL离心管中，编号备用。8.2.7 设施设备 用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面约5 cm2沉积物，将拭子置入灭菌15 mL离心管，加入适量灭菌PBS，浸泡5 min10 min，充分混匀，取出棉拭子，将离心管于4，8 000 g离心5 min，取上清液转入另一无菌5 mL离心管中，编号备用。8.2.8 样本的存放 采集或处理的样本在2 8 条件下保存应不超过24 h，若需长期保存，须放置于-80 冰箱，但应避免反复冻融。8.2.9 采样废弃物处理 DB44/T 23362021 5 采样结束，动物尸体应使用生物安全垃圾袋包装完整，高压灭菌后交由医疗垃圾处理单位进行处理，采样器材应使用消毒液浸泡或高压灭菌消毒，并做好实验台面及采样室的消毒。核酸提取 8.3.1 样本 RNA 提取 8.3.1.1 取 200 L 处理后的样本加 1 mL TRIzol 后，充分混匀，室温静置 10 min 使其充分裂解。8.3.1.2 加入 200 L 氯仿，盖紧样本管盖，用手用力振荡摇晃离心管 15 s，禁用漩涡振荡器，以免基因组 RNA 断裂。室温静置 5 min，4，10 000 g离心 15 min。8.3.1.3 离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 存在于水样层当中，水样层的容量大约为所加 TRIzol 容量的 60%。吸取上层水相，至另一离心管中，注意不要吸取中间界面。8.3.1.4 加入等量异丙醇混匀，室温放置 10 min，4，10 000 g离心 10 min，弃上清，RNA 沉淀一般形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。8.3.1.5 加入 1 mL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4，5