DB43T 895-2014 鮰类肠败血症检疫技术规程.pdf

DB43/T 8952014湖南省地方标准DB43鮰类肠败血症检疫技术规程Technical regulation of quarantine for Enteric Septicaemia of Catfish 湖南省质量技术监督局发 布ICS 65.020.30 41B2014-08-10 实施2014-06-10 发布湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 8952014 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 试剂和培养基 1 4 设备和器械 1 5 检疫方法 1 6 无害化处理 3 附录 A（资料性附录）鮰爱德华氏菌生化特性检测 4 湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 8952014 II 前 言 本标准按 GB/T 1.12009 的规则编制。本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。本标准起草单位：湖南农业大学动物科学技术学院。本标准主要起草人：肖克宇、钟蕾、戴振炎、江辉、何艳林、文祝友、谭情。湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 8952014 1 鮰类肠败血症检疫技术规程 1 范围 本标准规定了鮰类肠败血症(Enteric Septicaemia of Catfish，ESC)检疫的试剂和培养基、设备和器械、检疫方法和无害化处理。本标准适用于我省鮰类肠败血症的检疫。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7105 染疫水生动物无害化处理规程 SC/T 7214 鱼类爱德华氏菌检测方法 3 试剂和培养基 检验所需试剂、培养基的配制按 GB/T 4789.28、SC/T 7014 和 SC/T 7214 的规定执行。4 设备和器械 检验所需设备和器械等按 SC/T 7214 的规定执行。5 检疫方法 5.1 流行病学调查 鮰类肠败血症主要危害斑点叉尾鮰，黑鲈、鳗鲡、鲑鳟鱼等也可感染发病。鮰从鱼苗到成鱼均可发病，春、秋季水温（l828）为发病高峰期。饲养密度和环境胁迫等因素都会影响病原菌的致病性。鮰类肠败血症康复鱼体可检测到血清抗体。菌体可在鱼体内存活 4 个月以上，呈无症状带菌状态，并可通过粪便释放到水体，在水体沉积物中可存活很长时间，引起同群易感鱼发病。5.2 临床检查 5.2.1 群体检查 可见发病鱼池水质差，病鱼沿池边离群独游，反应迟钝，摄食量下降或不摄食，有的病鱼头朝上、尾向下呈垂直状游动，部分病鱼有时呈痉挛式的螺旋状游动。湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 8952014 2 5.2.2 个体检查 本病分“肠道败血型”和“头盖穿孔型”两种类型，以前者多见。5.2.2.1 肠道败血型：病鱼鳃丝苍白而有出血点，颌部、鳃盖和鳍基部皮肤出现淤斑和出血，有时会出现弥漫出血点或出血斑，有时则出现白色斑点；后期病鱼全身性水肿，腹部膨大，有的头部和躯体皮肤溃疡，一侧或两侧眼球突出，肌肉有点状出血或出血斑。5.2.2.2 头盖穿孔型：病鱼出现不规则游动或呆滞；后期头背颅侧部溃烂成深孔，脑组织裸露。5.2.2.3 解剖检查 病鱼体表出现溃疡，头盖穿孔。剖开腹腔，内有多量含血的或清亮的液体，不易凝固，肝水肿，质脆，有出血点和灰白色的坏死灶，脾、肾肿大和出血，胃膨大，肠道扩张、肠粘膜水肿、充血、发炎，肠腔内充满气体和淡黄色的水样液体。脑组织形成肉芽肿，肌肉具弥散性肉芽肿性炎症。5.2.3 临床检查判定 在流行病学调查、群体、个体检查中发现上述病症，可判定为疑似鮰类肠败血症。5.3 病原菌的分离与鉴定 鮰类肠败血症的病原体为肠杆菌科爱德华氏菌属的鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictalu)。5.3.1 采样与样品处理 采样按 SC/T 7103 的规定执行，样品处理按 SC/T 7214 的规定执行。5.3.2 细菌的分离纯化 取病鱼的肝、肾、脑组织按常规法划线接种血液琼脂平板，28培养 48h。从中挑取灰白色、圆形、湿润、呈半透明状的单个优势菌落在普通营养琼脂平板上再次划线分离纯化。5.3.3 分离菌的肠杆菌科特性检测 5.3.3.1 形态观察及染色 病料涂片美兰染色：取病鱼的肝、肾组织进行常规法涂片，按 SC/T 7014 和 SC/T 7214 的规定美兰染色。用光镜观察有否细菌及其形态特征。培养物涂片革兰染色：从纯化的分离菌培养物上挑取少许单菌落涂片，按 SC/T 7014 和 SC/T 7214的规定革兰染色，用光镜观察细菌的染色性和形态特征。5.3.3.2 运动性试验 按 GBT 4789.28、SCT 7214 的规定将分离菌穿刺接种于半固体琼脂两管，分别置 28、37下培养 24h。如分离菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性阳性；如分离菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，为运动性阴性。5.3.3.3 氧化酶试验 按 SCT 7014 和 SCT 7214 的规定，用毛细管吸取四甲基对苯二胺的 1%水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性，不变色为阴性。5.3.3.4 葡萄糖氧化与发酵（O/F）试验 湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 8952014 3 用接种针挑取分离菌菌落，穿刺并划线于 Hugh-Leifson 培养基上，于 28培养（1824）h，如开口管和封口管内的培养基都产酸（变黄）则分离菌为发酵型（F）、如开口管变黄色和封口管不变色则为氧化型（O）。5.3.4 分离菌的其它生化特性检测 鮰爱德华氏菌生化特性检测见附录 A，相关检测方法按 GBT 4789.28、SCT 7014 和 SCT 7214的规定进行。5.3.5 分离菌检测结果判定 肠杆菌科特性判定：病鱼肝、肾、脑组织接种的血液琼脂培养基上有细菌生长，且菌落形态特征符合本标准 5.3.3 的要求；美蓝染色的病料涂片中有蓝色无荚膜、无芽胞的小杆菌；革兰染色的纯培养菌为阴性杆菌；运动性检查，28下为阳性、37下为阴性；氧化酶试验为阴性；O/F 试验为发酵型。分离菌即可归属于为肠杆菌科。其它生化特性结果判定：鮰爱德华氏菌的生化特性检测参见附录 A。分离菌既符合肠杆菌科特性，又符合附录 A 结果，则分离菌鉴定为鮰爱德华氏菌。5.4 检疫结果综合判定 流行病学调查符合本标准 5.1 的规定，临床检查符合本标准 5.2 的规定，病原菌的分离与鉴定符合本标准 5.3.5 的规定，可确诊为鮰类肠败血症。6 无害化处理 诊断为鮰类肠败血症的病、死鱼及其接触的养殖水体、渔具等应按 SC/T 7105 的规定进行处理。湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 8952014 4 附录 A（资料性附录）鮰爱德华氏菌生化特性检测 项目 结果 项目 结果 吲哚产生*-甲基红试验-枸橼酸盐利用*-KCN 肉汤中生长-丙二酸钠利用*-V-P 反应-硫化氢产生*-醋酸盐利用-硝酸盐还原+ONPG-色素-尿素分解-苯丙氨酸脱氨酶-赖氨酸脱羧酶+精氨酸双水解酶-鸟氨酸脱羧酶 d 接触酶+DNA 酶-脂酶-明胶水解-D-葡萄糖产酸产气+D-侧金盏花醇-七叶苷水解-纤维二糖-卫茅醇-myo-肌醇-乳糖-麦芽糖+D-甘露醇-D-山梨醇+蜜二糖-甲基-D-葡萄糖苷-棉子糖-L-鼠李糖-水杨素-L-阿拉伯糖*-甘油-蕈糖（海藻糖）*-D-木糖-蔗糖*-酒石酸盐利用-D-甘露糖*-黏液酸盐-注：无符号“*”者为科内不同种属鉴别项目，有“*”者表示为属内种间鉴别项目。“+”为阳性反应，“-”为阴性反应，“d”为阳性或阴性反应。湖南省标准信息公共服务平台