DB13T 5221-2020 土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的测定 高效液相色谱-串联质谱法.pdf

ICS 11.120.10 C 12 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 52212020 土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的测定 高效液相色谱-串联质谱法 2020-09-18 发布 2020-10-18 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB13/T 52212020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河北省市场监督管理局提出。本标准起草单位：河北省环保产品质量监督检验院、张家口翼华环境检测技术有限责任公司、河北德普环境检测有限公司。本标准主要起草人：吕晓飞、蔡立鹏、耿晓红、陈静、刘肖肖、何淑娟、张玉、刘娜、孙鹏、王玲、米卫军、王天星。DB13/T 52212020 1 土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的测定高效液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的高效液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的测定。按称样量5 g，50 mL提取液中移取10 mL净化，净化液浓缩、定容至1.0 mL，进样量1 L分析，土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的检出限为2.5 g/kg，测定下限为10 g/kg。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 HJ/T 166 土壤环境监测技术规范 HJ 613 土壤干物质和水分的测定重量法 3 原理 土壤中四环素类抗生素用Na2EDTA-Mellvaine缓冲液（pH=4.0）+乙腈（7+3）提取，经过滤和离心后，上清液用HLB固相萃取柱净化。净化液中的四环素类抗生素经高效液相色谱分离，电喷雾离子源离子化，通过保留时间和特征离子对丰度比定性，峰面积外标法定量。4 干扰和消除 四环素类抗生素均属于高极性弱酸弱碱化合物，易与土壤中的金属离子、蛋白质结合，影响提取。通过Na2EDTA-Mellvaine缓冲液可有效防止金属离子与四环素类抗生素螯合。提取液中加入乙腈，并在低温下离心，可有效去除蛋白质的干扰。提取液经HLB固相萃取柱净化，可进一步去除干扰物质并有效降低基质对质谱的干扰效应。5 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。5.1 甲醇：色谱纯。5.2 乙腈：色谱纯。5.3 乙酸乙酯：色谱纯。5.4 甲酸：色谱纯。DB13/T 52212020 2 5.5 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTAH2O）。5.6 柠檬酸（C6H8O7H2O）。5.7 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）。5.8 柠檬酸溶液（0.1 mol/L）：称取 21.01 g 柠檬酸（5.6），用水溶解，定容至 1 000 mL。5.9 磷酸氢二钠溶液（0.2 mol/L）：称取 28.41 g 磷酸氢二钠（5.7），用水溶解，定容至 1 000 mL。5.10 Mellvaine 缓冲溶液：将 1 000 mL 0.1 mol/L 柠檬酸溶液（5.8）与 625 mL 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液（5.9）混合，必要时用氢氧化钠或盐酸调节 pH=4.0。5.11 Na2EDTA-Mellvaine 缓冲溶液（0.1 mol/L）：称取 60.5 g 乙二胺四乙酸二钠（5.5）放入 1 625 mL Mellvaine 缓冲溶液（5.10）中，使其溶解，摇匀。5.12 Na2EDTA-Mellvaine 缓冲溶液+乙腈（7+3）：量取 700 mL Na2EDTA-Mellvaine 缓冲溶液与 300 mL 乙腈混合。5.13 甲醇+水（1+19）：量取 5 mL 甲醇（5.1）与 95 mL 水混合。5.14 甲醇+乙酸乙酯（1+9）：量取 10 mL 甲醇（5.1）与 90 mL 乙酸乙酯（5.3）混合。5.15 HLB 固相萃取柱：二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮复合填料萃取柱（60 mg，3 mL），或其他性能相 5.16 近的固相萃取小柱。使用前用 5 mL 甲醇、5 mL 水活化处理，保持柱体湿润。5.17 甲酸水溶液（0.1%）：准确量取 1.0 mL 甲酸（5.4）于 1 000 mL 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。5.18 乙腈+甲酸水溶液（2+8）：量取 20 mL 乙腈（5.2）与 80 mL 甲酸水溶液（5.16）混合。5.19 标准物质：土霉素（oxytetracycline，CAS：6153-64-6）、金霉素（chlortetracycline，CAS：57-62-5）、四环素（tetracycline，CAS：60-54-8）、多西环素（doxycycline，CAS：564-25-0）、美他霉素（methacycline，CAS：914-00-1）。纯度均大于或等于 95%。5.20 标准储备液（100 g/mL）：准确称取土霉素、金霉素、四环素、多西环素和美他霉素各 10.0 mg，分别用甲醇溶解并定容至 100 mL，4贮存于密封棕色瓶中。5.21 混合标准中间液（1 000ng/mL）：准确吸取各标准储备液（5.19）1mL 于 100mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，4贮存于密封棕色瓶中。5.22 混合标准使用液：准确吸取混合标准中间液（5.20）0.1、0.5、1.0、2.0、5.0mL，于 5 个 10mL容量瓶中，用乙腈+甲酸水溶液（5.17）定容，此标准系列中各抗生素的浓度分别为：10、50、100、200、500 ng/mL。6 仪器与设备 6.1 高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。6.2 电子天平：感量 0.01g 和 0.0001g。6.3 快速混匀器。6.4 离心机：转速不低于 5000r/min。6.5 氮吹浓缩仪。6.6 固相萃取真空装置。6.7 pH 计：测量精度0.02。6.8 超声提取器。6.9 往复式振荡器（频率不低于 100 次/min）。6.10 一般实验室常用仪器和设备。DB13/T 52212020 3 7 样品 7.1 样品采集和保存 土壤样品按照HJ/T 166的相关要求进行采集和保存。样品应于洁净的具塞磨口棕色玻璃瓶中保存。运输过程中应密封、避光、4 以下冷藏。运至实验室后，若不能及时分析，应于4 以下冷藏、避光、密封保存，保存时间不超过10天。7.2 样品的制备 将样品混匀，除去样品中的异物（枝棒、叶片、石子等），按照HJ/T 166的要求，将采集的样品在实验室中自然风干、破碎、过60目筛，保存备用。如果土壤中水分含量较高（大于30%），应先进行离心分离出水相，再进行干燥处理。7.3 干物质的测定 土壤样品干物质含量按照HJ 613测定。7.4 试样的制备 7.4.1 提取 称取5 g（精确至0.0001g）土壤样品于50 mL离心管中，加入20 mL Na2EDTA-Mellvaine缓冲溶液+乙腈（7+3）（5.12），涡旋混匀1min使其分散，然后超声提取30 min、往复振荡（100次/min）提取30 min。取出离心管，5000 r/min条件下离心5 min，转移上清液至50 mL容量瓶中。再分别用20 mL、10 mL Na2EDTA-Mellvaine缓冲溶液+乙腈（7+3）（5.12）重复提取两次，合并上清液，定容至50 mL，用快速滤纸过滤，待净化。7.4.2 净化 准确移取10.0 mL滤液，以0.5 mL/min速度通过HLB固相萃取柱（5.15），然后依次用5 mL水和5 mL甲醇+水（5.13）淋洗，弃去淋洗液。2.0 kPa以下减压抽干5 min，用10 mL甲醇+乙酸乙酯（5.14）洗脱。将洗脱液氮吹浓缩至干，用1.0 mL乙腈+甲酸水溶液（5.17）溶解残渣，过0.22 m滤膜，待测定。7.5 空白试样的制备 不称取样品，按照与试样制备（7.4）相同的步骤进行空白试样的制备。8 分析步骤 8.1 色谱参考条件 a)色谱柱：联苯色谱柱（3.0 mm50 mm，2.6 m），或相当者；b)流动相：乙腈（5.2）+甲酸水溶液（5.16），梯度洗脱（梯度洗脱程序见表 1）；c)流速：0.5 mL/min；d)柱温：35；e)进样量：1 L。DB13/T 52212020 4 表1 梯度洗脱程序 时间/min 乙腈/%甲酸水溶液/%0 20 80 3.5 30 70 3.6 60 40 4.5 60 40 4.6 20 80 5.5 20 80 8.2 质谱参考条件 离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI+）；质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；其他参考质谱条件见附录A。8.3 定性测定 待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在0.5%之内。每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标物的两个离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围。表2 定性时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50%20%50%10%20%10%允许的相对偏差 20%25%30%50%8.4 定量分析 在8.1和8.2仪器条件下，对系列标准溶液（5.21）和试样溶液（7.4.2）进行分析。以标准样品中四环素类抗生素的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做线性回归方程，计算出试样溶液中四环素类抗生素的浓度。标准溶液的色谱图参见附录B。8.5 空白试验 按照与试样测定（8.1）相同的仪器条件进行空白试样（7.5）的测定。9 结果计算与表示 土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素和美他霉素的含量X 按式（1）计算：(1)式中：X土壤中各被测组分的含量，单位为微克每千克（g/kg）；Ci试样溶液中各被测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；C0空白试样溶液中各被测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；DB13/T 52212020 5 V试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；m试样质量，单位为克（g）；wdm土壤样品的干物质含量，单位为（%）；f稀释因子。计算结果保留三位有效数字，当计算结果1000 g/kg时，可将结果折算成 mg/kg单位表示，保留三位有效数字。10 精密度和准确度 六家实验室分别对土霉素加标浓度为2.26 g/kg、11.3 g/kg和56.5 g/kg的土壤统一样品进行了6次重复测定：实验室间相对标准偏差范围分别为7.7%19.6%、1.9%20%和1.8%10.4%；实验室间加标回收率范围分别为82.5%94.6%、88.7%103.8%和98.3%111.5%。六家实验室分别对金霉素加标浓度为2.18 g/kg、10.9 g/kg和54.6 g/kg的土壤统一样品进行了6次重复测定：实验室间相对标准偏差范围分别为6.1%17.3%、4.1%14.7%和1.4%10.8%；实验室间加标回收率范围分别为80.7%101.0%、94.2%108.8%和94.2%103.6%。六家实验室分别对四环素加标浓度为2.40 g/kg、12.0 g/kg和60.1 g/kg的土壤统一样品进行了6次重复测定：实验室间相对标准偏差范围分别为7.5%15.6%、5.7%21.2%和3.0%8.6%；实验室间加标回收率范围分别为83.8%100.7%、93.9%112.3%和99.8%105.8%。六家实验室分别对多西环素加标浓度为2.22 g/kg、11.1 g/kg和55.5 g/kg的土壤统一样品进行了6次重复测定：实验室间相对标准偏差范围分别为7.5%18.1%、5.2%23.5%和2.6%13.2%；实验室间加标回收率范围差分别为83.5%93.2%、84.4%104.8和97.4%101.3%。六家实验室分别对美他霉素加标浓度为2.24 g/kg、11.2 g/