DB15T 99-2020 鸡白痢防制技术规程.pdf

ICS 11.220 B 41 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB 15/T 992020 代替 DB15/T 99-1993 鸡白痢防制技术规程 Prevention technical specifications for pullorum disease 2020-07-30 发布 2020-08-30 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB 15/T 992020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准代替了DB15/T 991993鸡白痢病防制技术规程，与DB15/T 991993相比，除编辑性修改外主要技术变化如下：名称修改为鸡白痢防制技术规程；删除了扑灭标准及消灭标准（见1993版的4.1）；增加了净化标准的相关内容（见4.2.2）；修改了诊断技术（见2，1993版的2）。本标准由内蒙古自治区农牧厅归口。本标准起草单位：内蒙古自治区动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：萨茹拉、马立峰、郭宇、申捷、张伶俐、贾皓、云涛、苏胜杰、戴晓光、王永杰、特木尔巴根、武娅楠、赵心力。本标准的历次版本发布情况为：DB15/T 991993。DB 15/T 992020 1 鸡白痢防制技术规程 1 范围 本标准规定了鸡白痢的诊断技术、防制措施和净化措施。本标准适用于饲养、经营、运输、屠宰、加工鸡（火鸡）的单位和个人。2 诊断技术 2.1 流行特点 鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起的一种不同品种、不同日龄的鸡均易感的传染病。本病的传染源主要是病鸡和带菌鸡，有水平传播和垂直传播多种途径，三周龄内雏鸡发病率和病死率高。2.2 临诊诊断 2.2.1 雏鸡 潜伏期一般为 4 d7 d。病雏表现为怕冷、精神沉郁、昏睡、羽毛逆立，排出白色粘稠或淡黄色、淡绿色稀便，羽毛与肛门周围不洁。少数出现呼吸困难、关节肿胀、失明等症状，最后衰竭死亡。2.2.2 育成鸡及成年鸡 多呈慢性或隐性感染，症状不明显，表现为因卵黄囊炎引起的腹膜炎，腹膜增生而呈“垂腹”现象，母鸡产蛋量与受精率下降。2.3 病理变化 2.3.1 雏鸡 多呈急性死亡，病理变化不明显。病程稍长呈现心肌、肺、肝、盲肠、大肠及肌胃肌肉中有坏死灶或结节，胆囊肿大，输尿管扩张等病理变化。盲肠中有干酪样物，常有腹膜炎。稍大的病雏有出血性肺炎，肺部有灰黄色结节。2.3.2 育成鸡 肝肿大，呈现暗红色或深紫色，表面可见散在或弥散性的小红色或黄白色大小不一的坏死灶，质地极脆，常见有出血变化。2.3.3 成年鸡 成年母鸡常见为卵子变形、变色、呈现囊状，有腹膜炎及腹腔脏器粘连，常有心包炎。成年公鸡睾丸极度萎缩，输精管腔增大，充满稠密的均质渗出物。2.4 实验室诊断 2.4.1 细菌分离鉴定 DB 15/T 992020 2 2.4.1.1 采集病料 无菌采集被检鸡的肝、脾、肺、卵巢等脏器，取脏器组织 5 g10 g，研磨后进行病原分离培养。2.4.2 分离培养 2.4.2.1 试剂 增菌培养基：亚硒酸盐煌绿增菌培养基、四硫磺酸钠煌绿增菌培养基。鉴别培养基：SS琼脂、麦康凯琼脂。2.4.2.2 操作 将研磨的病料分别接种在亚硒酸盐煌绿增菌培养基、四硫磺酸钠煌绿增菌培养基、SS 琼脂或麦康凯琼脂培养基平皿上，37 培养24 h48 h，在SS琼脂或麦康凯琼脂培养基平皿上若出现白色或半透明、圆形的光滑菌落，判定为可疑菌落。若在鉴别培养基上无可疑菌落出现时，应从增菌培养基中取菌液在鉴别培养基上划线分离，37 培养 24 h48 h，若有可疑菌落出现，则进一步做鉴定。2.4.2.3 病原鉴定 2.4.2.3.1 生化试验和运动性检查 2.4.2.3.1.1 试剂 三糖铁琼脂和半固体琼脂。2.4.2.3.1.2 操作 将可疑菌落穿刺接种在三糖铁琼脂斜面，并在斜面上划线，同时接种在半固体培养基，37 培养24 h 后观察。2.4.2.3.1.3 结果判定 若无运动性，并在三糖铁琼脂上出现阳性反应时，则进一步做血清学鉴定；若有运动性，说明不是鸡白痢沙门菌感染。三糖铁琼脂典型阳性反应为斜面产碱、变红，底层产酸、变黄；部分菌株斜面和底层均产酸、变黄，半固体琼脂阳性反应为穿刺线呈现毛刷状。2.4.3 全血或血清平板凝集试验 2.4.3.1 试剂 鸡白痢多价染色平板抗原、强阳性血清（500 IU/mL）、弱阳性血清（10 IU/mL）、阴性血清。2.4.3.2 器材 玻璃板、移液器、枪头等。2.4.3.3 操作步骤 在 20 25 环境条件下，用移液器吸取抗原 30 L，垂直滴于玻璃板上，然后取被检鸡的全血或分离后所得血清 30 L，与抗原混合均匀，并使其散开至直径约为 2 cm，计时判定结果。同时，设置强阳性对照、弱阳性对照和阴性血清对照。DB 15/T 992020 3 2.4.3.4 结果判定 2.4.3.4.1 凝集试验判定标准 100%凝集（+）：紫色凝集块大而明显，反应液清亮；75%凝集（+）：紫色凝集块较明显，反应液有轻度浑浊；50%凝集（+）：出现明显的紫色凝集颗粒，反应液较为浑浊；25%凝集（+）：仅出现少量的细小颗粒，反应液浑浊；2.4.3.4.2 0%凝集（-）无凝集颗粒出现，反应液浑浊。2.4.4 PCR 检测 2.4.4.1 试剂 10PCR Buffer、dNTP、Taq 酶、DL2000DNA Marker、乙醇、DEPC 水、TAE、琼脂糖、阳性对照（已鉴定的鸡白痢沙门菌）和阴性对照。2.4.4.2 器材 1.5mL灭菌离心管、恒温水浴锅、离心机、混匀器、电泳仪、PCR仪、凝胶成像仪等。2.4.4.3 DNA 模板的制备 取灭菌的 1.5 mL 离心管，做好标识。每管加入 600 L 裂解液，分别加入被检样本（增菌培养物、研磨好的组织上清）、阴性对照、阳性对照各 200 L，再加入 200 L 氯仿，混匀器上振荡混匀 5 s，于4 12000 r/min 离心 15 min；取灭菌的 1.5 mL 离心管，加入-20 预冷 400 L 异丙醇，吸取裂解好的被检样本、阴性对照、阳性对照上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀；于 4 12000 r/min 离心 15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入 600 L 75%预冷乙醇，颠倒洗涤；于 4 12000 r/min 离心 15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；10000 r/min 离心 10 s，用微量加样器将其吸干，室温干燥 510 min；加入 15 L DEPC 水，溶解管底的 DNA，5000 r/min、离心 5 s，-20 保存备用。2.4.4.4 PCR 反应体系 PCR反应体系见表1。表1 PCR反应体系（总体积为48 L）无菌超纯水 34.75 L 10 PCR Buffer（含 Mg2+）5 L dNTP（2.5 mmol/L）4 L speC 上游引物（10 mol/L）1 L speC 下游引物（10 mol/L）1 L Taq 酶（5 U/L）0.25 L DNA 模板 2 L DB 15/T 992020 4 2.4.4.5 PCR 扩增程序 将上述加有DNA模板的PCR管，置于PCR仪内进行反应。PCR反应条件为：95 预变性5 min，95 变性30 s，56 退火30 s，72 延伸30 s，30个循环，72 延伸7 min。2.4.4.6 电泳 用TAE（配制方法见附录A）制备1.5%2.0%的琼脂糖凝胶，加样6 L8 L，在电压80 V100 V、电流40 mA下进行电泳30 min40 min。2.4.4.7 结果判定 2.4.4.7.1.1 试验成立条件 当阴性对照和空白对照不出现条带、阳性对照出现清晰条带，试验成立。（参照附录 B 进行判定)2.4.4.7.1.2 判定 若被检样品扩增出约252 bp的片段，判定为鸡白痢阳性。3 防制措施 3.1 预防 3.1.1 消毒 3.1.1.1 制定生物安全制度，对进入鸡场的人员、物品等进行严格消毒。3.1.1.2 鸡舍、鸡笼、墙面、地面、运输工具等可用 1%的高效消毒剂、0.1%的新洁尔灭、2%的火碱等药液定期喷洒消毒。3.1.1.3 孵化设施在使用前用福尔马林密闭熏蒸消毒。3.1.2 药物预防 用敏感类药物对初生雏鸡（115日龄）进行药物预防。3.1.3 鼠害防控 鼠类是沙门菌的主要携带者，对鸡场进行灭鼠，防止由鼠类传播沙门菌。3.1.4 饲料防控 对购入的饲料进行隔离、检疫、消毒，合格的饲料方可进入鸡场。3.2 检疫净化 3.2.1 蛋用种鸡场须在开产前，通过全血或血清平板凝集试验进行 2 次检疫，相隔时间不得少于 21天，检出并淘汰阳性鸡。3.2.2 肉用种鸡场须在45日龄至开产之间，通过全血或血清平板凝集试验每月检疫1次，相隔时间不得少于 21 天，检出并淘汰阳性鸡。3.2.3 商品代饲养场户以预防为主，引入的鸡只应选自检疫鸡白痢沙门菌且为阴性的鸡场。DB 15/T 992020 5 4 疫病控制 4.1 疫病控制方法 4.1.1 坚持自繁自养，需引进鸡只时提前检测鸡白痢沙门菌。4.1.2 制定完善的生物安全制度，严格管控进入鸡场的人员、设备、车辆、物品等。4.1.3 对进入鸡场的人员、设备、车辆、物品等进行彻底清理及消毒。4.1.4 对出现全血或血清平板凝集试验阳性的鸡只及时淘汰，并对病鸡所在鸡笼、饲料槽、饮水槽等进行彻底清理及消毒，同群鸡只隔离观察两周后，无异常情况的可在无污染区域进行饲养。4.2 疫病控制要求 4.2.1 控制标准 连续两年每个月抽检存栏数的1%2%，用全血或血清平板凝集试验检测，抽检阳性率在0.5%以下即达到控制要求。4.2.2 净化标准 达到控制标准后，每个月抽检全群，连续两年全血或血清平板凝集试验检测结果均为阴性即达到净化标准。DB 15/T 992020 6 附录 A（规范性附录）PCR 反应溶液的配制 TAE 电泳缓冲液（pH 约 8.5）的配制要求如下：50TAE 电泳缓冲储存液 三羟甲基氨基甲烷（Tris 碱）242 g 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）37.2 g 双蒸水 800 mL 待上述混合物完全溶解后，加入57.1 mL的醋酸充分搅拌溶解，加双蒸水至1 L后，置室温保存。应用前，用双蒸水将50TAE电泳缓冲液50倍稀释。DB 15/T 992020 7 附录 B（资料性附录）PCR 检测鉴定结果 B.1 鸡沙门菌 PCR引物序列见表B.1。表 B.1 PCR 引物序列 检测目的基因 speC 上游引物 speC 下游引物 speC 基因 CGGTGTACTGCCCGCTAT CTGGGCATTGACGCAAA B.2 鸡沙门菌 PCR 电泳图见图 B.2。表 B.2 PCR 电泳图 说明：M1 DL 2000 DNA Maker；1 沙门菌；2 阳性对照；3 阴性对照；4 100bp DNA Ladder。_