DB15T 1238-2017 绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心ELISA检测技术.pdf

ICS 65.020.30 B 41 备案号：55651-2017 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 12382017 绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心 ELISA 检测 技术 Detection of double antibody sandwich ELISA for envelope protein of jaagsiekte sheep retrovirus(JSRV)2017-09-10 发布 2017-12-10 实施 内蒙古自治区质量技术监督局 发 布 DB15/T 12382017 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 试剂.2 6 材料与设备.2 7 样品前处理.2 8 操作方法.2 9 结果判断.3 附录 A（规范性附录）试剂配制目录.5 DB15/T 12382017 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由内蒙古质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：内蒙古农业大学。本标准起草人：刘淑英、刘月。DB15/T 12382017 1 绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心 ELISA 检测技术 1 范围 本标准规定绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心ELISA检测技术的试剂、材料与设备、样品前处理、操作方法、结果判定等。本标准适用于内蒙古自治区检测临床疑似病羊、进出境种羊外周血液样品中绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白，和羊临床样品中绵羊肺腺瘤病病原的快速检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 绵羊肺腺瘤病毒 Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV 绵羊肺腺瘤病毒（JSRV）是引起绵羊肺腺瘤病（OPA）的病原。该病毒属单股正链 RNA 逆转录病毒，其病毒的囊膜蛋白是具有转化细胞和致癌功能的蛋白质，位于病毒粒子的最外层，是构成病毒粒子的主要结构蛋白。3.2 双抗体夹心 ELISA 技术 double antibody sandwich ELISA 指特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体抗原固相抗体复合物显色来检测抗原含量的技术。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件：a)JSRV：绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）；b)exJSRV：外源性绵羊肺腺瘤病毒(exogenous jaagsiekte sheep retrovirus，exJSRV)；c)enJSRV：内源性绵羊肺腺瘤病毒（endogenous jaagsiekte sheep retrovirus，enJSRV）；d)OPA：绵羊肺腺瘤病（ovine pulmonary adenomatosis，OPA）；DB15/T 12382017 2 e)ELISA：酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）；f)PBS：抗体样品稀释液(磷酸盐缓冲液,Phosphate Buffered Saline，PBS）；g)PBST：洗涤液(PBS+Tween-20，PBST)；h)HRP：辣根过氧化物酶（hydrogen-peroxide oxidoreductase，HRP）。5 试剂 5.1 除非另有说明，在检测中使用的化学试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 中三级水的要求。5.2 红细胞裂解液（配制见附录 A 中 A.1）。5.3 抗体样品稀释液（配制见附录 A 中 A.2）。5.4 包被缓冲液（配制见附录 A 中 A.3）。5.5 包被抗体（配制见附录 A 中 A.4）。5.6 检测抗体（配制见附录 A 中 A.5）。5.7 洗涤液（配制见附录 A 中 A.6）。5.8 封闭液（配制见附录 A 中 A.7）。5.9 TMB 底物显色液（配制见附录 A 中 A.8）。5.10 底物终止液 2M H2SO4（配制见附录 A 中 A.9）。6 材料与设备 6.1 微量加样器。量程分别 0.2 L2 L、1 L10 L、10 L100 L、20 L200 L 和 100 L1000 L 的移液器，并配备与移液器相匹配的吸头。6.2 4 -20 冰箱。6.3 电热恒温培养箱。6.4 96 孔酶标板。6.5 自动酶标检测仪。6.6 旋涡振荡器。7 样品前处理 取新鲜抗凝血5 mL，3000 r/min离心15 min，弃上清，按1:5的比例向细胞沉淀中加入冰箱预冷的红细胞裂解液混匀，4 静置10 min，期间上下颠倒混匀5次，1000 r/min离心5 min，离心弃去上层红色液体，收集沉淀部分。如果沉淀还有红色，可重新加入红细胞裂解液，重复1遍；向沉淀中加入样品稀释液200 L，反复冻融或室温静置1 h使细胞破裂，期间不时在旋涡振荡器上混合；1000 r/min离心5 min，取上清液进行检测。8 操作方法 8.1 包被 ELISA 板每孔加 100 L 包被缓冲液稀释过的包被抗体（浓度约 0.0386 mg/mL），4 下过夜包被。DB15/T 12382017 3 8.2 洗涤 用滤纸拍干，用PBST液洗板5次。8.3 封闭 ELISA 板每孔加入封闭液200 L，37 下孵育1 h。8.4 洗涤 用滤纸拍干，用PBST液洗板5次。8.5 加待检样品 ELISA 板每孔加待检样品 100 L，37 下孵育 1 h。加入阳性对照，阴性对照和 PBS 空白对照。注：阳性对照是鉴定为自然感染JSRV病毒的绵羊肺腺瘤病肺组织提取蛋白，阴性对照为未感染绵羊肺腺瘤病的绵羊健康肺组织提取蛋白.8.6 洗涤 用滤纸拍干，用PBST 液洗板5次。8.7 加酶标抗体 ELISA 板每孔加稀释过的酶标抗体 100 L（浓度约为 0.0116 mg/mL），37 下孵育 1 h。8.8 洗涤 用滤纸拍干，用PBST液洗板5次。8.9 显色 ELISA板每孔加TMB显色液100 L，避光15 min30 min。8.10 终止 ELISA板每孔加终止液100 L。8.11 读值 终止反应后将ELISA板置于自动酶标仪上，在450 nm波长下读取光吸收OD值。9 结果判断 9.1 结果分析条件设定 阳性对照平均 OD 值与阴性对照平均 OD 值的比值大于 2.1，空白对照平均 OD 值小于或等于阴性对照平均 OD 值，检测结果有效。否则应检查实验操作并进行重测。9.2 阳性判定标准 被检样品 OD 值与阴性对照 平均 OD 值的比值大于等于 2.1 判定为阳性。DB15/T 12382017 4 9.3 阴性判定标准 被检样品 OD 值与阴性对照平均 OD 值的比值小于 2.1 判定为阴性。DB15/T 12382017 5 A A 附 录 A（规范性附录）试剂配制目录 A.1 红细胞裂解液 NH4CL 8.29 g，KHCO3 1.00 g，Na2EDTA 37.2 mg溶于1000 mL蒸馏水，调pH 至7.4。A.2 抗体样品稀释液 NaCl 8.0 g，KH2PO4 0.27 g，Na2HPO4 1.42 g，KCl 0.2 g 溶于1000 mL蒸馏水，调pH 至 7.4。A.3 包被缓冲液 Na2CO3 1.599 g，NaHCO3 2.939 g，溶解于800 mL去离子水中，调节pH至9.6，定容到l L,4 保存备用。A.4 包被抗体 JSRV囊膜蛋白抗原表位富集区段的蛋白作为抗原，按常规方法免疫新西兰白兔，制备包被抗体。A.5 酶标抗体 JSRV囊膜蛋白抗原表位特异区段的蛋白作为抗原，按常规方法免疫小鼠，制备检测抗体。用HRP标记试剂盒标记检测抗体，制备酶标抗体。A.6 洗涤液 1L PBS溶液加入0.5 mL吐温20（Tween-20）室温保存。A.7 封闭液 含10%脱脂乳的PBST溶液。A.8 TMB底物显色液 底物显色A液：醋酸钠13.6 g，柠檬酸1.6 g，H2O2（30%）0.3 mL，dH2O 500 mL。底物显色B液（避光保存）：EDTA-Na 0.2 g，柠檬酸0.95 g，甘油50 mL，TMB(四甲基联苯胺)0.2 g用DMSO溶解为10 mg/mL后再加dH2O 500 mL，使用时A液和B液等体积混匀。DB15/T 12382017 6 A.9 底物终止液 取2 mol/L H2SO4 22.2 mL 缓缓加入到177.8 mL去离子水中。_