DB42T 1621-2021 辣椒炭疽病抗性鉴定技术规程.pdf

ICS 65.020.20 CCS B05 DB42 湖北省地方标准 DB42/T 16212021 辣椒炭疽病抗性鉴定技术规程 Technical regulation for evaluation of pepper resistance to anthracnose disease 2020-12-30 发布 2021-03-01 实施 湖北省市场监督管理局 发 布 DB42/T 16212021 I 目次 前言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 接种体制备.1 5 室内抗性鉴定.2 6 病情调查.3 7 抗病性评价.3 8 记载表格.3 附录 A（资料性）辣椒炭疽病的分类及症状.4 附录 B（资料性）辣椒炭疽病分离物 PCR 检测方法.5 附录 C（资料性）辣椒炭疽病抗性鉴定病情分级标准、评价标准、抗性评价统计表.7 DB42/T 16212021 II DB42/T 16212021 III 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖北省农业科学院经济作物研究所提出。本文件由湖北省农业农村厅归口。本文件起草单位：湖北省农业科学院经济作物研究所、湖北省蔬菜办公室、湖北兆至现代农业科技股份有限公司、利川市南坪蔬菜专业合作社。本文件主要起草人：王飞、李宁、尹延旭、姚明华、焦春海、周雄祥、高升华、余楚英、张成、肖明兆、陈勇、张益、陈财。本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-87665821，邮箱：。对本文件的有关修改意见建议请反馈至湖北省农业科学院经济作物研究所，联系电话：027-87380819，邮箱：。DB42/T 16212021 1 辣椒炭疽病抗性鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了辣椒炭疽病抗性鉴定的接种体制备、抗性鉴定方法、病情调查、抗病性评价以及记载表格的基本要求。本文件适用于湖北省辣椒炭疽病的抗病性鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 2060.1 辣椒抗病性鉴定技术规程 第1部分：辣椒抗疫病鉴定技术规程 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 接种体制备 PDA 培养基 制备PDA培养基1 L，应称取洗净去皮的马铃薯200 g，切成小块，置于锅中加水煮0.5 h左右，在烧杯上用纱布过滤马铃薯残渣，收集滤液置于干净锅中，加入15 g20 g琼脂，加热搅拌溶解后，再加入葡萄糖20 g搅拌均匀，冷却后定容至1L，分装于试管或者锥形瓶中，加塞、包扎后121，灭菌30 min后取出，试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。接种体的分离 采集田间具有典型炭疽病症状的果实，用常规组织分离法从果实病斑上获得分离物（参见附录A）。接种体的鉴定 分离物经肉眼观察培养性状、菌落形态特征初步确认为胶孢炭疽菌后，用分子生物学方法（参见附录B）验证。接种体保存 将鉴定的新鲜胶孢炭疽菌进行3 次单孢分离纯化后，转接于含PDA斜面培养基的5 cm试管中，28 下黑暗培养3 d后，在斜面上加入距试管口1 cm的灭菌矿物油后置于4 保存。生产上的接种体宜每年分离、复壮1 次。接种体复壮 DB42/T 16212021 2 将保存在PDA斜面培养基上的接种体置于28 下黑暗培养3 d，从菌丝边缘用打孔器截取直径0.5 cm的菌丝块接种在表面消毒的感病辣椒果实上，置于温度为28、湿度为90%的环境中光照和黑暗（12 h/12 h）交替培养，等果实发病后进行病原菌分离。接种孢子制备 将复壮分离后获得的病原物接种在PDA培养基上，置于28、湿度为90%的环境中黑暗培养7 d，待菌丝长满平板后，将平板置于28、湿度为90%的环境中光照和黑暗（12 h/12 h）交替培养，待产生分生孢子后，用无菌水清洗分生孢子，用3层灭菌的擦镜纸过滤菌丝，制成浓度为1105 个/mL分生孢子悬浮液。5 室内抗性鉴定 试验设计 取辣椒青熟果（花后35 d40 d）或红熟果（花后45 d50 d），每个鉴定品种或材料设3 次重复，每个重复10 个果实，一半接种分生孢子悬浮液，一半用无菌水做对照。试验环境 应具备人工调节温度、湿度和光照的条件，使接种后具备良好的发病环境。对照材料 感病对照品种：“茄门甜椒”，中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。抗病对照品种：“PBC 932”，亚洲蔬菜中心提供。鉴定材料准备 鉴定材料适时播种、育苗、定植、采摘，按照常规田间管理（不喷施杀菌剂），保持鉴定材料的一致性。鉴定材料的育苗应符合NY/T 2060.1的要求。确保果实形状和成熟度一致、无病虫为害症状，用清水洗净，晾干或置于超净工作台上吹干，放入75%的乙醇溶液中浸泡2 min，用1%次氯酸钠溶液浸泡2 min，用无菌水洗净，置于超净工作台晾干。接种 5.5.1 接种体浓度 接种分生孢子悬浮液1 L，浓度为1105 个/mL。接种无菌水1 L。5.5.2 接种方法 采用微量注射法接种，在果实中部用微注射器刺出一个深1 mm，直径0.4 mm的伤口并注入1 L的分生孢子悬浮液。每个果实接种23 个点。5.5.3 接种后的管理 接种后，置于适宜规格的透明带盖塑料整理箱中，箱底铺设4 层湿润的灭菌滤纸，接种点朝上并用保鲜膜密闭。置于室内28 黑暗保湿（相对湿度100%）24 h，培养条件控制为：温度28，相对湿度80%100%，每天光照和黑暗各12 h。DB42/T 16212021 3 6 病情调查 调查时间 接种后5 d7 d开始病情调查。调查方法 按照附录C表C.1的病情分级描述，逐一观察果实每一接种处的病斑扩展情况，记载各病级病果数，并将发病结果记入附录C表C.3。病情分级 辣椒炭疽病的病情分级参见附录C的表C.1。病情记载 调查记载每一鉴定果实的病情级别，计算病情指数（Disease index:DI）。病情指数按公式(1)计算：DI=()100 (1)式中：DI病情指数；s各病情级别的果实数；n相对病情级别的数值；N调查总果数；S 最高病情级别的代表数值。7 抗病性评价 抗病性评价标准 依据鉴定材料3次重复的病情指数（DI）的平均值确定其抗病水平，划分标准见附录C表C.2。鉴定结果的有效性判别 当感病对照的病情指数DI30，该批次的抗炭疽病鉴定即为有效。8 记载表格 统计鉴定品种的病情指数，将结果记载在附录C表C.3。DB42/T 16212021 4 A A 附录A （资料性）辣椒炭疽病的分类及症状 A.1 辣椒炭疽病及其分类 辣椒炭疽病是由半知菌亚门刺盘孢属（Colletotrichum spp.）致病菌种引起的一种常见辣椒病害，在湖北省该病害病原菌有5 个种，包括胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）、黑色炭疽病菌（C.coccodes）、黑点炭疽病菌（C.capsici）、尖孢炭疽菌（C.acutatum）和黑线炭疽菌（C.dematium）等。在中国，侵染辣椒青果和红果的炭疽病菌以胶孢炭疽菌为主。A.2 辣椒炭疽病的症状 果实染病，病斑表面初生水渍状，逐渐扩展为褐色凹陷、中心着生黑（红）点的圆形或不规则形状病斑。叶片染病，初现水浸状褪绿斑，逐渐扩大成中间灰白色、四周褐色的圆形或近圆形病斑；茎杆染病，病部呈现不规则或梭形病斑，纵裂凹陷，见图A.1和图A.2。图A.1 炭疽病菌分离与接种 图A.2 田间辣椒炭疽病爆发 DB42/T 16212021 5 B B 附录B （资料性）辣椒炭疽病分离物 PCR 检测方法 B.1 试剂及配方 B.1.1 TE缓冲液配方 1TE Buffer（500 mL）：1 mol/L Tris-HCl Buffer，pH 8.0，5 mL；0.5 mol/L EDTA，pH 8.0，1 mL；均匀混合定容到500 mL，高温高压灭菌后，室温保存。B.1.2 DNA抽提液配方 2%CTAB裂解液（1L）：NaCl 82 g，EDTA 7.44 g，Tris 12.12 g，CTAB 20 g，PVP 2 g，用dd H2O定容至1 L，常温保存，使用时可加入1%的-巯基乙醇。B.1.3 TAE电泳缓冲液配方 50Tris-乙酸（TAE）电泳缓冲液：242 g Tris；57.1 mL冰乙酸；100 mL 0.5 M EDTA（pH=8.0）；去离子水定容至1000 ml，室温保存。B.2 CTAB 法提取分离物 DNA 将保存的病原菌菌株在PDA培养基上、28 暗培养7 d10 d后，将培养基表面菌丝轻轻刮下，液氮中研磨。在1.5 mL离心管中，加入500 L的 2CTAB和20 L-巯基乙醇，混匀后置于65 水浴中保温45 min60 min，并不时轻轻转动离心管。加入等体积的氯仿：异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10000 r/min 离心10 min，转移上清液至另一新离心管中。加入2 倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇，出现絮状沉淀后，-20 放置30 min，12000 r/min离心10 min15 min，回收DNA沉淀。用70%的乙醇清洗沉淀2 次，吹干后溶于适量的灭菌水中。B.3 定性 PCR 检测 B.3.1 PCR反应体系和PCR引物 PCR反应体系和PCR引物分别见表B.1和表B.2。表B.1 PCR 反应体系 组成 加样体积 模板DNA 2.0 L ITS4 1.0 L ITS6 1.0 L Taq Master Mix 8.5 L ddH2O 12.5 L 总体积 25.0 L DB42/T 16212021 6 表B.2 PCR 通用引物 引物名称 引物序列 PCR产物大小 辣椒炭疽病 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 600bp ITS6 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG B.3.2 PCR反应循环参数 94 预变性5 min；94 变性40s；56 退火40 s；72 延伸45s；30个循环；70 终延伸10 min，并置于4 保存。B.3.3 PCR扩增产物检测 扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳后，BIO-RAD凝胶成像系统进行紫外显影拍照。B.3.4 PCR扩增产物序列分析 回收目的条带，交由生物公司测序。分析测序获得的rDNA-ITS序列，在Gene Bank数据库中BLAST，比较序列与炭疽菌(Colletotrichum spp.)的ITS序列的同源性。DB42/T 16212021 7 C C 附录C （资料性）辣椒炭疽病抗性鉴定病情分级标准、评价标准、抗性评价统计表 辣椒炭疽病抗性鉴定病情分级标准、评价标准、抗性评价鉴定结果见记载表C.1、表C.2和表C.3。表C.1 辣椒炭疽病的病情分级标准表 病情级别 病情描述 0 无病斑 1 0.10 cm病斑直径0.40 cm 3 0.40 cm病斑直径0.70 cm 5 0.70 cm病斑直径1.00 cm，病斑上无霉或有少量霉层 7 1.00 cm病斑直径1.50 cm，病斑上霉层较多 9 病斑直径1.50 cm，病斑上有大量霉层 表C.2 辣椒抗/感炭疽病品种（种质）的抗性评价标准表 病情指数（DI）抗性评价 DI=0 免疫（I）0DI3 高抗（HR）3DI10 抗病（R）10DI30 中抗（MR）DI30 感病（S）表C.3 辣椒抗炭疽病品种(种质)的鉴定结果记载表 编号 品种/种质 名称 来源 重复 序号 病情分级 病情 指数 平均 病指 抗性 评价 0 1 3 5 7 I II III 播种时间 接种时间 接种生育期 病原物编号 生理小种类型 调查时间 技术负责人 （签字）