DB42T 734-2011 牛分枝杆菌 抗体胶体金试纸条检测方法.pdf

ICS 11.220B 41备案号：DB42湖北省地方标准DB42/T 7342011牛分枝杆菌 抗体胶体金试纸条检测方法Colloidal Gold Strips to Detect the Antibody against Mycobacterium bovis2011-08-18 发布2011-09-18 实施湖北省质量技术监督局发 布DB42/T 7342011I目次前言.II引言.III1范围.12术语与定义.13缩略语.14原理.15牛结核病抗体胶体试纸条检测方法.25.1仪器与耗材.25.2操作步骤.2附录 A（规范性附录）采样与样品处理注意事项.3附录 B（规范性附录）牛分枝杆菌 MPB70/83 抗体检测胶体金试纸条的制备.4DB42/T 7342011II前言本标准按 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本文件的发布机构提请注意，声明符合文件时，可能涉及到附录B与胶体金试纸条制备相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：专利持有人姓名：华中农业大学。地址：武汉市洪山区狮子山街1号。请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由华中农业大学提出。本标准由湖北省农业厅归口。本标准起草单位：华中农业大学。本标准起草人：郭爱珍、陈颖钰、廖娟红、晁金、凌洁玉、陈焕春、杨利国、胡长敏。DB42/T 7342011III引言牛结核病主要是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种人兽共患的慢性传染病，呈世界性分布。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须通报疫病与国际贸易必检对象，我国将其列为二类动物疫病。临床上以肺结核、乳房结核和肠结核最为常见，健康牛可通过被污染的空气、饲料和饮水等经呼吸道和消化道等途径感染。随着近年来我国奶牛业的蓬勃发展，我国牛结核病呈上升趋势。我省近年来奶牛养殖数量不断增加，牛结核病防控形势严峻。国际通用的牛结核病控制方法是“检疫扑杀”，因此，准确检测牛结核病是净化与控制牛结核病的前提。目前法定的检疫方法为牛结核菌素皮内变态反应，该方法操作费时繁琐，需要专业技术人员操作，结果判断程序复杂且主观性强，在环境分枝杆菌感染时易出现假阳性反应，免疫抑制或结核病病程后期动物对结核菌素的反应性降低。牛分枝杆菌抗体胶体金检测试纸条是用牛分枝杆菌特异性蛋白检测牛分枝杆菌抗体的一种方法。该方法简化了牛结核病检测的操作程序，可在栏圈旁检测，省时省力，简便快速。本标准的出台将为牛结核病的快速诊断提供有力的技术依据，有助于我省乃至全国养牛业的健康发展。DB42/T 73420111牛分枝杆菌 抗体胶体金试纸条检测方法1范围本标准规定了牛分枝杆菌抗体胶体金试纸条检测方法的原理和操作步骤。本标准适用于牛结核病的诊断、检疫、监测与流行病学调查。2术语与定义下列术语与定义适用于本标准。2.1胶体金colloidal gold strip金原子和胶体（如牛血清蛋白）通过静电引力、范氏力等结成的组合体。2.2多克隆抗体 polyclonal antibody多种抗原表位刺激机体免疫系统后，机体产生的针对不同抗原表位的混合抗体。3缩略语3.1磷酸盐缓冲液 phosphate buffer solutionPBS3.2牛分枝杆菌特异性蛋白 70MPB703.3牛分枝杆菌特异性蛋白 83MPB834原理牛感染牛分枝杆菌后，会产生针对该菌的特异性抗体，其中MPB70和MPB83是刺激抗体产生的重要细菌蛋白，且具有抗原相似性。将胶体金标记MPB83，并加至金标垫上，将MPB70（检测带蛋白）和MPB83多克隆抗体（质控带蛋白）分别包被在硝酸纤维素膜上，将金标垫、硝酸纤维素膜、样本垫、吸水垫和PVC背撑等一起组装成检测板。待检牛血清加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，与金标垫上的胶体金标记MPB83相遇并结合，当进一步移动至固定的MPB70区域时，待检血清与金标MPB83的结合物又与MPB70发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，肉眼即可观察到检测线上的胶体金显色带。待检血清与金标MPB83的结合物进一步移动至固定的MPB83抗体区域时，又与MPB83抗体反应，肉眼即可观察到质控线上的胶体金显色带。因此，牛结核病阳性时，胶体金试纸条出现检测带与质控带两条带；而牛结核病阴性时，则只出现一条质控带。DB42/T 734201125牛结核病抗体胶体试纸条检测方法5.1仪器与耗材滴管、高压消毒锅、一次性注射器。牛分枝杆菌MPB70/83抗体检测胶体金试纸条，应符合相关产品的质量标准（见附录B）。5.2操作步骤5.2.1样品处理无菌采集待检牛血液2 mL，分离血清，立即检测或-20 保存待检。5.2.2胶体金试验操作步骤取待检血清样品100 L120 L（滴管5滴6滴），缓慢滴加到样品孔中，试纸条上将有红色条带移动。若一分钟后仍然没有条带移动，向样品孔中再加入1滴待检血清样品。静置10 min，观察结果。5.2.3结果判定结果判断如下图所示。(1)阳性结果（A）：在试纸条上出现两条红色条带（检测带和质控带）。(2)阴性结果（B）：在试纸条上仅出现一条红色条带（质控带）。(3)无效结果（C和D）：在质控带处不出现红色条带。质 控 带检 测 带DB42/T 73420113AA附录A（规范性附录）采样与样品处理注意事项本附录规定了采样与样品处理注意事项。A.1采血及血样处理过程，应进行无菌操作。存放血样的容器应洁净和无菌。A.2采样及实验过程中应注意个人防护，戴口罩、穿工作服和戴一次性手套。A.3待用的带滤芯吸嘴、吸嘴和离心管等应经过高压灭菌处理。A.4每次操作后应及时用 70%乙醇或 10%次氯酸钠溶液消毒处理检测区。操作区应有专门的废弃物容器，废弃物应经高压消毒后方可按有关规定处置。A.5应符合病原微生物实验室生物安全管理条例的其它生物安全技术要求。DB42/T 73420114BB附录B（规范性附录）牛分枝杆菌 MPB70/83 抗体检测胶体金试纸条的制备附录B给出了牛分枝杆菌MPB70/83抗体检测胶体金试纸条的制备标准。克隆表达和纯化MPB70和MPB83，制备和纯化兔抗MPB83蛋白多克隆抗体和MPB83-胶体金复合物。将MPB83-胶体金复合物加至金标垫上，将MPB70（检测带）和MPB83多克隆抗体（质控带）分别包被在硝酸纤维素膜上，将金标垫、硝酸纤维素膜、样本垫、吸水垫和PVC背撑等一起组装成检测试纸条。_