DB36T 1397-2021 畜禽羽（毛）中利巴韦林及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法.pdf

ICS 67.080.20 B 31 DB36 江西省地方标准 DB36/T 1397-2021 畜禽羽（毛）中利巴韦林及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of residues of ribavirin and its metabolite in animal feather(hair)HPLC-MS/MS method 2021-04-23 发布 2021-11-01 实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 1397-2021 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 原理.1 4 试剂和材料.1 5 仪器和设备.2 6 试样制备与保存.3 7 测定步骤.3 8 结果与计算.5 9 方法灵敏度、准确度和精密度.5 附录 A（资料性）利巴韦林、1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺和 13C5-利巴韦林定量离子色谱图.6 DB36/T 1397-2021 II 前 言 本文件是按照GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，南昌市农业科学院。本文件主要起草人：周瑶敏，徐俊，赖博文，许晶晶，周军，罗林广，胡丽芳，费丹，邬磊，谢敏，闵佳玲，侯玉洁，肖勇，万伟杰，姚瑶，余云云。DB36/T 1397-2021 1 畜禽羽（毛）中利巴韦林及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本文件规定了畜禽羽（毛）中利巴韦林及其代谢物液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于猪、牛、羊、鸡羽（毛）中利巴韦林及其代谢物1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺残留量的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样经2%甲酸-甲醇溶液提取，乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和十八烷基硅烷（C18）分散净化，液相色谱-串联质谱测定，同位素内标法定量。4 试剂和材料 4.1 试剂 水符合GB/T 6682规定的一级水。4.1.1 甲醇：色谱纯。4.1.2 甲酸：色谱纯。4.1.3 乙酸铵：色谱纯。4.2 溶液配制 4.2.1 1%SDS：称取 1 g 十二烷基磺酸钠，加水溶解，转移至 100 mL 容量瓶中，定容至刻度，混匀。4.2.2 2%甲酸-甲醇：量取 2 mL 甲酸（4.1.2），加甲醇（4.1.1）稀释，转移至 100 mL 容量瓶中，用甲醇（4.1.1）定容至刻度，混匀。4.2.3 2 mmol/L 乙酸铵溶液：称取约 154 mg 乙酸铵（4.1.3），加水溶解，转移至 1000 mL 容量瓶中，定容至刻度，混匀。4.3 标准品 DB36/T 1397-2021 2 4.3.1 利巴韦林（Ribavirin，CAS 号：36791-04-5），纯度 98.0%。4.3.2 1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺（TCONH2，CAS 号：3641-08-5），纯度 98.0%。4.3.3 13C5-利巴韦林（13C5-Ribavirin，CAS 号：1646818-35-0），纯度 99.0%。4.4 标准溶液的配制 4.4.1 100 mg/L 标准储备液：分别准确称取利巴韦林和 TCONH2标准品各 1 mg（精确至 0.1 mg），分别于 10 mL 容量瓶中，用甲醇配制成 100 mg/L 的标准储备液，于-18 下保存，有效期 6 个月。4.4.2 1 mg/L 混合标准中间液：用移液管吸取 1 mL 利巴韦林和 TCONH2标准储备液（4.4.1）于 100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀得到 1 mg/L 的混合标准中间液，于 4 下保存，有效期 3 个月。4.4.3 100 mg/L 内标储备液：准确称取13C5-利巴韦林标准物质约 1 mg，精密称定，于 10 mL 容量瓶中，用甲醇配制成 100 mg/L 的内标储备液，于-18 下保存，有效期 6 个月。4.4.4 1 mg/L 内标中间液：用移液管吸取内标储备液（4.4.3）1 mL 于 100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀得到 1mg/L 的内标中间液，于 4 下保存，有效期 3 个月。4.4.5 混合标准工作溶液：根据每种标准的灵敏度和线性范围，移取适量的混合标准中间液（4.4.2）和内标中间液（4.4.4），用水稀释至合适浓度，临用现配。4.5 材料 4.5.1 乙二胺-N-丙基硅烷（PSA），粒径 40 m-60 m。4.5.2 十八烷基硅烷（C18），粒径 40 m-60 m。4.5.3 十二烷基磺酸钠（SDS）。4.5.4 微孔滤膜：有机相：0.22 m。5 仪器和设备 5.1 液相色谱-串联质谱：配电喷雾离子源。5.2 分析天平：感量 0.1 mg 和 0.01 g。5.3 高速离心机：转速 5000 r/min。5.4 涡旋仪。5.5 恒温烘箱。5.6 氮吹仪。5.7 水浴恒温振荡器。6 试样制备与保存 6.1 试样制备 从动物毛发根部剪取羽（毛），用1%SDS（4.2.1）清洗羽（毛）30 min，然后用水冲洗干净，再用试纸吸干水，于45 烘箱中烘1 h，剪碎成1 mm-2 mm。6.2 试样保存 常温下放干燥器中保存。7 测定步骤 DB36/T 1397-2021 3 7.1 提取 准确称取 0.2 g（精确至 0.1 mg）上述处理的羽（毛）样品于 50 mL 具塞离心管中，分别加入 10 L 13C5-利巴韦林内标中间液（4.4.4）和 10 mL 2%甲酸-甲醇（4.2.2）溶液，置于 65 水浴 2 h，取出，涡旋 1 min，超声 15 min，在 5000 r/min 下离心 5 min，取上清液于另一 50 mL 具塞离心管中。离心后的残渣加入 10 mL 2%甲酸-甲醇（4.2.2）溶液，重复提取一次，合并上清液，混匀。7.2 净化 将 7.1 上清液中加入 150 mg PSA 和 150 mg C18 吸附剂，涡旋 30 s，然后在 5000 r/min 下离心 5 min，收集上清液至离心管中并在 45 条件下氮气吹至近干，残渣用 1 mL 0.1%甲酸水溶液溶解，过 0.22 m的滤膜，供测定。7.3 色谱质谱参考条件 7.3.1 液相色谱参考条件如下：a）色谱柱：ZORBAX SB-Aq（100 mm 3.0 mm，1.8 m），或性能相当者；b）流动相：流动相A为2 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸），流动相B为甲醇；c）流速：0.4 mL/min；d）柱温：35；e）进样量：5.0 L；f）流动相和梯度洗脱条件见表1。表 1 梯度洗脱参考条件 时间，min 流动相 A，%流动相 B，%0 100 0 2.5 100 0 3.5 2.0 98 6.0 2.0 98 7.0 100 0 7.3.2 质谱参考条件如下：a）离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI+）；b）毛细管电压：3000 v；c）干燥气温度：150；d）干燥气流量：15 L/min；e）雾化气压力：35 psi；f）鞘气温度：300；g）鞘气流量：11 L/min；h）检测方式：多反应监测（MRM），监测条件见表2。表2 多反应监测（MRM）参考条件 被测物名称及内标名称 定性离子对，m/z 定量离子对，m/z 碎裂电压，V 碰撞能量，eV 利巴韦林 245.1/113 245.1/113 380 10 245.1/96 30 TCONH2 113/96 113/96 380 20 113/69 25 13C5-利巴韦林 250/113 250/113 380 8 DB36/T 1397-2021 4 7.4 标准工作曲线 吸取一定量混合标准中间溶液，用水逐级稀释成质量浓度为0.1 g/L、0.2 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L的标准工作溶液，其中含13C5-利巴韦林浓度均为10 g/L，临用现配，供液相色谱-串联质谱仪测定。以利巴韦林及其代谢物的定量离子对和内标13C5-利巴韦林的峰面积之比为纵坐标，以标准工作液的浓度作为横坐标，绘制标准曲线。7.5 定性及定量 7.5.1 保留时间 被测试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在 2.5%之内。7.5.2 定量离子、定性离子及子离子丰度比 在相同实验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰保留时间与标准品相一致，并且在扣除背景后的样品质谱中，目标物的质谱定量和定性离子均出现，而且同一检测批次，样品中目标物的定性离子和定量离子的相对丰度比与质量浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的目标物。表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度，%50 2050 1020 10 允许的最大偏差，%20 25 30 50 7.5.3 定量测定 内标法定量：用标准工作溶液分别进样，以目标物和内标物的峰面积比为纵坐标，以分析物和内标物的浓度比为横坐标作标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，标准工作液和待测工作液中目标物的响应值均应在仪器检测的定量测定线性范围之内，超过线性范围时应根据测定浓度进行适当倍数稀释后再进行分析。在上述色谱-质谱条件下，利巴韦林、1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺和13C5-利巴韦林标准溶液定量离子色谱图参见附录A。7.6 空白试验 除不加试样外，均按上述步骤进行。8 结果与计算 试样中利巴韦林和TCONH2的残留量按式（1）计算。10001000mVX （1）式中：X试样中利巴韦林和 TCONH2的含量，单位为微克每千克(g/kg)；从标准曲线中查得的试样提取溶液中利巴韦林和TCONH2的浓度，单位为微克每升(g/L)；DB36/T 1397-2021 5 V样液最终定容体积(mL)；m所取试样的量，单位为克(g)；注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9 方法灵敏度、准确度和精密度 9.1 灵敏度 本方法对利巴韦林及其代谢物的检出限为0.2 g/kg。本方法对利巴韦林及其代谢物的定量限为0.5 g/kg。9.2 准确度 本方法在0.5 g/kg 5.0 g/kg添加浓度水平上的回收率为92.7%110.4%。9.3 精密度 在重复性条件下，2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的15%。DB36/T 1397-2021 6 附录A（资料性）利巴韦林、1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺和13C5-利巴韦林定量离子色谱图 图A.1 利巴韦林、1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺和13C5-利巴韦林标准溶液(10.0 g/L)定量离子色谱图 1-利巴韦林定量离子色谱图（245.1113）2-1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺定量离子色谱图（11396）3-13C5-利巴韦林定量离子色谱图（250113）_