DB42T 1843-2022 牛结核病多方法联合诊断规程.pdf

ICS 65.020 CCS B 10 DB42 湖北省地方标准 DB42/T 18432022 牛结核病多方法联合诊断规程 Code of practice of multiple diagnostic tests for bovine tuberculosis 2022-03-23 发布 2022-05-23 实施 湖北省市场监督管理局 发 布 DB42/T 18432022 I 目 次 前言.III 引言.IV 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 单皮内变态反应和 ELISA 抗体检测法联合.2 6 ELISA 抗体检测法和 IFN-体外释放法联合.2 7 单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合.3 8 单皮内变态反应和 IFN-体外释放法联合.4 9 临床剖检和/或细菌培养和 PCR 检测分型法联合.4 10 生物安全操作要求.6 DB42/T 18432022 II DB42/T 18432022 III 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由华中农业大学提出。本文件由湖北省农业农村厅归口。本文件起草单位：华中农业大学、湖北劲牛牧业有限公司、高安市裕丰农牧有限公司。本文件主要起草人：陈颖钰、郭爱珍、章恺伦、闫钰、胡长敏、李翔、曾稳兵、杨建军、陈焕春。本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-87665821，邮箱：；对本文件的有关修改意见建议请联系华中农业大学，电话：027-87286861，邮箱：。DB42/T 18432022 IV 引 言 牛结核病（Bovine Tuberculosis）是由结核分枝杆菌复合群成员牛分枝杆菌、结核分枝杆菌及山羊分枝杆菌等感染导致的一种慢性消耗性人兽共患病，临床呈慢性经过，导致肺结核、肠结核、乳腺结核等多器官结核。在我国一、二、三类动物疫病的病种名录中，牛结核病规定为二类疫病。国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）中，奶牛结核病被列为优先防治的动物病种。由于国家对牛结核病采取检疫扑杀策略进行控制和净化，准确诊断牛结核病是牛结核病控制、净化的重要前提。然而牛结核病诊断缺乏快速、灵敏、低成本、适合于现场诊断的金标准。现有诊断方法包括：皮内变态反应（单皮内变态反应及比较皮内变态反应）、IFN-体外释放法、ELISA抗体检测法、临床剖检诊断、细菌学诊断及PCR检测等。皮内变态反应是牛结核病检测中最经典的方法，敏感性高，成本相对低，但特异性较差，操作费时、费力；IFN-体外释放法是目前灵敏性和特异性均高的检测方法，48 h之内就可以出结果，但价格最为昂贵，且具有较高的实验室技术要求。该两种方法主要针对牛结核病的细胞免疫反应阶段，均适合于牛结核病的早期检测。ELISA抗体检测方法操作成熟，简便、快捷，适合于高通量检测；由于主要针对牛结核病的体液免疫反应阶段，适合于牛结核病的晚期检测。临床剖检诊断是基于观察结核结节等病理变化的死后诊断方法，适合于牛结核病的追踪溯源，但不适合于临床活体检测。结核分枝杆菌培养和种型鉴定准确性高，但敏感性差，耗时长，且需在生物安全三级实验室进行操作，同样不适合于临床检测。PCR检测能够对带菌组织样本或培养物进行种型鉴定，但由于牛结核病具有慢性经过和持续感染等特征，活体采样往往难以达到检测所需的菌量，因此，也不适合于活体检测。为了在现有技术条件下提升牛结核病检测的敏感性和特异性，最大限度地减少假阳性牛错杀和假阴性牛漏检，本文件从各方法的检测原理、敏感性和特异性以及检测成本等多方面综合考虑，制定了一套适用于牛结核病不同流行背景和检测条件的多方法联合诊断方案，对牛结核病多方法联用的条件和技术进行了规定，以期为临床牛结核病的精准诊断提供依据。DB42/T XXXX2022 1 结核病多方法联合诊断规程 1 范围 本文件规定了牛结核病多方法联合诊断规程中的单皮内变态反应和ELISA抗体检测法联合、ELISA抗体检测法和IFN-体外释放法联合、单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合、单皮内变态反应和IFN-体外释放法联合、临床剖检和/或细菌培养和PCR检测分型法联合以及生物安全要求等。本文件适用于牛结核病检疫、监测和净化过程中的诊断。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB/T 18645-2020 动物结核病诊断技术 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27639-2011 结核病病原菌实时荧光PCR检测方法 GB/T 32945-2016 牛结核病诊断 体外检测干扰素法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 牛结核病 bovine tuberculosis 牛结核病是由牛分枝杆菌、结核分枝杆菌及山羊分枝杆菌等结核分枝杆菌复合群成员感染所引起的一种慢性细菌性疾病，包括持续感染和活动性结核病两种类型。3.2 个体流行率 individual prevalence 一段时间内某群体中患病的动物总数与同时间该群体暴露动物数之比。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。DMSO：二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide）ELISA：酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）IFN-：伽马干扰素（Interferon-）PCR：多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）DB42/T XXXX2022 2 5 单皮内变态反应和 ELISA 抗体检测法联合 5.1 适用对象 同时具备临床检测和实验室检测操作条件，且牛结核病个体流行率小于3%的场群。5.2 操作步骤 按照GB/T 18645-2020中6.3.1所规定的步骤对待检牛进行单皮内变态反应（以下简称单皮试法）检测，再对单皮试法检测为阴性的个体，使用商品化ELISA抗体检测试剂盒进行进一步检测。5.3 结果判定 单皮试法检测为阳性，或ELISA抗体检测法检测为阳性的牛均判为结核阳性。5.4 单皮试法和 ELISA 抗体检测法联合诊断流程图 单皮试法和ELISA抗体检测法联合诊断流程如图1所示。图1 单皮内变态反应和抗体检测法联合诊断流程图 6 ELISA 抗体检测法和 IFN-体外释放法联合 6.1 适用对象 具备实验室检测操作条件，且牛结核病个体流行率小于3%的场群。6.2 操作步骤 使用ELISA抗体检测试剂盒对待检牛进行牛结核病抗体检测，再对ELISA抗体检测为阴性的个体，按照GB/T 32945-2016中4.3所规定步骤进行牛结核IFN-体外释放法检测。6.3 结果判定 ELISA抗体检测法检测为阳性，或IFN-体外释放法检测为阳性的牛均判为结核阳性。6.4 ELISA 抗体检测法和 IFN-体外释放法联合诊断流程图 ELISA抗体检测法和IFN-体外释放法联合诊断流程如图2所示。DB42/T XXXX2022 3 图2 ELISA 抗体检测法和 IFN-体外释放法联合诊断流程图 7 单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合 7.1 适用对象 不具备实验室检测操作条件，且牛结核病个体流行率大于等于3%的场群。7.2 操作步骤 按照GB/T 18645-2020中6.3.1所规定的步骤对待检牛进行单皮试法检测，再对单皮试法检测为阳性的个体，按照GB/T 18645-2020中6.3.1所规定的步骤进行比较皮内变态反应（以下简称比较皮试法）检测。7.3 结果判定 单皮试法和比较皮试法检测均为阳性的牛判为结核阳性。7.4 单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合诊断流程图 单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合诊断流程如图3所示。图3 单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合诊断流程图 DB42/T XXXX2022 4 8 单皮内变态反应和 IFN-体外释放法联合 8.1 适用对象 牛场具备实验室检测操作条件，且牛结核病个体流行率大于等于3%的场群。8.2 操作步骤 按照GB/T 18645-2020中6.3.1所规定的步骤对待检牛进行单皮试法检测，再对单皮试法检测为阳性的个体，按照GB/T 32945-2016中4.3所规定步骤进行IFN-体外释放法的检测。8.3 结果判定 单皮试法和IFN-体外释放法检测均为阳性的牛判为结核阳性。8.4 单皮内变态反应和 IFN-体外释放法检测联合诊断流程图 单皮试法结合IFN-体外释放法检测联合诊断流程如图4所示。图4 单皮内变态反应和 IFN-体外释放法联合诊断流程图 9 临床剖检和/或细菌培养和 PCR 检测分型法联合 9.1 适用对象 屠宰场宰杀牛或病死牛，或需要进行牛结核病临床剖检、细菌培养或PCR检测分型的牛。9.2 操作步骤 9.2.1 临床剖检 对屠宰场宰杀牛或病死牛进行解剖，对牛的头、肺、肝、脾、肠、乳房、以及纵隔淋巴结、肝门淋巴结、肠系膜淋巴结、肺门淋巴结、乳房上淋巴结进行观察和触诊，检查是否存在疑似结核结节。对有结节处切开检查其是否存在化脓性病变和干酪样坏死病变。组织出现疑似结核结节时，按照GB/T 27639-2011中第7章所规定方法采集病变组织，在具备牛结核病原操作资质的条件下，对采集的病变组织进行牛结核病细菌分离培养，并进行PCR检测分型；在不具备牛结核病原操作资质的条件下直接进行PCR检测和分型。9.2.2 牛结核病细菌分离培养 DB42/T XXXX2022 5 牛结核病细菌分离培养工作需要在生物安全三级实验室进行。按照GB/T 18645-2020 动物结核病诊断技术中步骤5.5进行牛结核病细菌的分离培养。9.2.3 PCR 检测和分型法 9.2.3.1 样本处理及核酸提取 依照商品化核酸提取试剂盒的使用说明进行样本的处理，并提取组织内核酸，直接用于PCR检测或储存于-80条件下备用。9.2.3.2 PCR 模板 PCR模板为本文件9.2.3.1步骤中提取的待检测样品的核酸样本。同时取灭活的结核分枝杆菌或结核分枝杆菌核酸为阳性对照。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。9.2.3.3 PCR 引物 本文件提供了针对结核分枝杆菌复合群的特异性引物序列（表1）。分别以16SrRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8和Rv3120基因序列为模板设计特异性引物。依照提供的序列进行引物合成。表1 结核分枝杆菌复合群特异性引物序列 核酸序列核酸序列 引物1（16SrRNA）上游引物 5-ACG GTG GGT ACT AGG TGT GGG TTT C-3 下游引物 5-TCT GCG ATT ACT AGC GAC TCC GAC TTC A-3 引物2（Rv0577）上游引物 5-ATG CCC AAG AGA AGC GAA TAC AGG CAA-3 下游引物 5-CTA TTG CTG CGG TGC GGG CTT CAA-3 引物3（IS1561）上游引物 5-GCT GGG TGG GCC CTG GAA TAC GTG AAC TCT-3 下游引物 5-AAC TGC TCA CCC TGG CCA CCA CCA TTG ACT-3 引物4（Rv1510）上游引物 5-GTG CGC TCC ACC CAA ATA GTT GC-3 下游引物 5-TGT CGA CCT GGG GCA CAA ATC AGT C-3 引物5（Rv1970）上游引物 5-GCG CAG CTG CCG GAT GTC AAC-3 下游引物 5-CGC CGG CAG CCT CAC GAA ATG-3 引物6（Rv3877/8）上游引物 5-CGA CGG GTC TGA CGG CCA AA