DB37T 4436-2021 禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病毒联合净化技术规程.pdf

ICS 11.220 CCS B 41 37 山东省地方标准 DB37/T 44362021 禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病毒联合净化技术规程 Technical regulations for elimination of avian leukosis virus and reticuloendotheliosis virus 2021-11-17 发布 2021-12-17 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 44362021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、山东农业大学、山东益生种畜禽股份有限公司。本文件主要起草人：胡莉萍、成子强、薛婧雯、周德方、陈静、江芳、张心悦。DB37/T 44362021 1 禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病毒联合净化技术规程 1 范围 本文件规定了禽白血病病毒和禽网状内皮组织增殖病病毒的实验室检测技术要求和联合净化程序。实验室检测包括抗原的ELISA检测、RT-PCR检测和病毒分离鉴定。本文件适用于原种鸡群、祖代鸡群和父母代种鸡群的净化。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 禽白血病病毒与禽网状内皮增殖病病毒实验室检测技术 4.1 器材 高温高压灭菌锅(温度范围：105 134；额定压力：0.23 Mpa)、离心机（转速：2 000 rpm14 000 rpm）、PCR仪、二氧化碳恒温细胞培养箱、分光光度计、酶标仪、冰箱。4.2 材料与试剂 4.2.1 无 RNase 水。4.2.2 商品化的 ALV 与 REVELISA 抗原检测试剂盒。ALV 和 REVELISA 抗原检测试剂盒均通过检测泄殖腔拭子，分别检测 ALV 所有亚群共有的抗原 p27 蛋白，或 REV 的主要免疫原性蛋白 p30，从而对 ALV 和REV 的感染情况进行判定。4.2.3 商品化的 RNA 提取试剂盒。4.2.4 商品化的 RNA 反转录试剂盒。4.2.5 PBS 缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.42 g（Na2HPO412H2O 3.58 g），KH2P04 0.27 g溶于蒸馏水，定容为 1 000 mL，过滤后高温高压灭菌备用。4.2.6 细胞生长培养基：商品化的 DMEM 液，加 10%胎牛血清，青霉素、链霉素各 250 IU/mL，储存于4 冰箱备用。4.2.7 细胞维持培养基：配制方法同 4.2.6，使用胎牛血清浓度为 1%。4.2.8 ALV-A gp85、ALV-B gp85、ALV-J gp85 及 REV gp90 基因片段的特异性引物，具体引物序列见附录 A。4.2.9 除特别规定外，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 的要求。DB37/T 44362021 2 4.3 样品 4.3.1 血液样品：母鸡翅下静脉抽取 1 mL 静脉血，制备血清；公鸡抽取 1 mL 静脉血，2 000 rpm 离心，制备血浆，储存于-20 冰箱备用。4.3.2 泄殖腔棉拭子样品：用无菌棉签插入泄殖腔内，擦拭后将棉签放入装有 1 mL PBS 缓冲液的离心管内，1 2000 rpm 离心 2 min 后将上清等分为 2 份，将进行抗原检测的样品储存于-20 冰箱备用，将进行病毒分离及 RNA 提取的样品储存于-80 冰箱备用。检测样品前，棉拭子应反复冻融 2 次3 次，4，1 2000 rpm 离心 2 min3 min，吸取上清。血清样品于室温融化，500 倍稀释，用于检测。4.3.3 蛋清样品：将蛋壳灭菌后，用镊子将种蛋钝端敲破，使用移液器从破壳处沿蛋壳内壁伸入蛋内约 1 cm，吸取 1 mL 蛋清，并储存于-20 冰箱备用。4.4 病毒抗原的 ELISA 检测 4.4.1 操作方法：采用商品化的 ELISA 试剂盒检测泄殖腔棉拭子或蛋清。按照试剂盒提供的检测步骤操作。4.4.2 结果判定：按试剂盒提供的算法判定。ALV-p27 和 REV-p30 抗原其中之一为阳性，淘汰来源雏鸡。如两者均可疑或其中之一为可疑，则需进行 RT-PCR 检测或病毒分离。4.5 RT-PCR 检测 4.5.1 操作方法 4.5.1.1 RNA 及 cDNA 提取：将冻存于液氮罐内的棉拭子 PBS 溶液用商品化试剂盒提取 RNA，用分光光度计测浓度后，用商品化试剂盒反转录成 cDNA。RNA 储存于-80 冰箱，cDNA 储存于-20 冰箱。4.5.1.2 PCR 及电泳检测：完成 RNA 提取和将 RNA 反转录成 cDNA 后，以 cDNA 为模板，利用 ALV-A gp85、ALV-B gp85、ALV-J gp85 及 REV gp90 基因片段的特异性引物分别进行 PCR 扩增。扩增产物于 120 V，120 mA，使用 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。剩余的 RNA 保存于-80 冰箱，cDNA 保存于-20 冰箱。4.5.2 结果判定 琼脂糖凝胶电泳中出现ALV-A特异的1020bp片段、ALV-B特异的1038bp片段、ALV-J特异的545 bp片段或REV特异的292 bp的片段时，可判定病毒检测阳性。具体反应体系及条件参见附录B。4.6 病毒分离 4.6.1 操作方法 4.6.1.1 DF-1 细胞传代培养：取生长状态良好的 DF-1 细胞传代并用细胞生长培养基培养至少 8 h，待细胞密度达到 60%70%后用于病毒分离。4.6.1.2 病毒液感作 DF-1 细胞：在二氧化碳培养箱培养了至少 8 h 的 DF-1 细胞弃去细胞生长培养基，将 1 mL 棉拭子样品 PBS 液或 1 mL 血清/血浆注入培养瓶/培养板/培养皿内，作用于 DF-1 细胞，将细胞放在二氧化碳培养箱内作用 1 h 后更换细胞维持培养基，培养至少 3 d。4.6.1.3 p27/p30 抗原检测：采用商品化的 ELISA 检测试剂盒检测。4.6.2 结果判定 p27抗原阳性，可判定为ALV感染；p30抗原阳性，可判定REV感染。4.7 结果处理 DB37/T 44362021 3 淘汰泄殖腔棉拭子ALV-p27与REV-p30均为阳性或任一为阳性的鸡只；淘汰泄殖腔棉拭子ALV-p27与REV-p30均为可疑或任一为可疑且RT-PCR为阳性的鸡只；淘汰泄殖腔棉拭子ALV-p27与REV-p30均为可疑或任一为可疑且病毒分离为阳性的鸡只。5 养禽场禽白血病与禽网状内皮组织增殖病联合净化程序 在养禽场对禽白血病与禽网状内皮组织增殖病进行联合净化，需按以下顺序开展净化工作，依次完成多个世代的ALV与REV检测、净化，直至建立阴性禽群。5.1 孵化室雏鸡检测 5.1.1 操作方法：检测应从原种鸡群开始，收集鸡群的种蛋，同一只种鸡来源的种蛋放在一起，分群孵化，采集全部 1 日龄雏鸡的胎粪，分别用 ALV-p27 抗原 ELISA 检测试剂盒检测 p27 抗原，用 REV-p30抗原 ELISA 检测试剂盒检测 p30 抗原。任一检测中有一只雏鸡为阳性，则同一种鸡来源的雏鸡均判为阳性，淘汰而不作种用。对选留的阴性雏鸡，以母鸡为单位，同一母鸡的雏鸡放于一个笼中隔离饲养（25只50 只）。5.1.2 注意事项：每个笼间不可直接接触，包括避免直接气流的对流。饲养期间要采取避免横向传播的各种措施。接种疫苗时避免共用注射器。5.2 后备种鸡检测 采集全部5周6周龄鸡血清和泄殖腔棉拭子，分离培养ALV和REV。选出阴性鸡，隔离饲养，作为后备种鸡。5.3 种鸡开产初期检测 开产初期，每只鸡取2枚3枚蛋，取蛋清的混合样品，使用ALV-p27抗原ELISA检测试剂盒检测蛋清中的p27抗原，使用REV-p30抗原ELISA试剂盒检测蛋清中的p30抗原。淘汰抗原阳性鸡。5.4 20 周25 周龄留种前检测 每只鸡取2枚3枚蛋对蛋清进行p27、p30抗原检测，淘汰阳性鸡。原则同上。公鸡则采集血浆接种DF-1细胞分离病毒，淘汰阳性种蛋。5.5 种蛋的选留和孵化 在经8.4步留种前检测淘汰阳性鸡后，每只母鸡仅选用1只检测阴性公鸡的精液授精。按规定时间留足种蛋，每只母鸡的种蛋均标号。在出壳前，将每只母鸡的种蛋置于同一标母鸡号的专用纸袋中，置于出雏箱中出雏。5.6 第二世代鸡的检测淘汰 经上述8.18.5的检测淘汰后种鸡的出壳的雏鸡，作为净化后第二代鸡。继续按8.18.5的程序，实施第二世代的检测和净化。第三世代后可按此程序继续循环进行。5.7 公鸡检测程序 5.7.1 孵化室 1 日龄雏鸡检测，同母鸡（先收集胎粪一次，再鉴别雌雄）。5.7.2 第一次挑选公鸡时，采集血浆进行病毒分离检测。在开始供精之前，至少经过病毒分离检测一次。DB37/T 44362021 4 5.7.3 在生产阶段采血浆进行病毒分离检测一次。5.7.4 每 6 个月抽检血清样品，监测 p27 抗原和 p30 抗原。5.8 净化标准 连续进行多个世代种鸡的ALV与REV检测与净化，病原学抽检，原种场全部为阴性，祖代场和父母代场阳性率低于1%；血清学抽检，A/B亚群抗体和J亚群抗体（采用商品化的ELISA检测试剂盒检测），原种场全部为阴性，祖代场和父母代场阳性率低于1%；连续两年以上无临床病例；即为达到禽白血病与禽网状内皮组织增殖病净化状态。5.9 耗材的无害化处理 检测阳性的鸡和所有用毕的耗材见病死及病害动物无害化处理技术规范（农医发201725号）。DB37/T 44362021 5 A A 附录A （资料性）RT-PCR 引物信息 禽白血病病毒（ALV）与网状内皮增殖病病毒（REV）RT-PCR检测所需引物序列。引物浓度均为10 pmol。表A.1 ALV 与 REV RT-PCR 检测所需引物序列、产物长度、扩增目的及其用途 病毒 引物名称 序列 长度 扩增目的 用途 ALV-A 上游引物 5-CGCGGATCCGATGTTCACTTACTCGAGC-3 1020bp 禽白血病病毒A亚群（ALV-A）gp85 基因片段 扩增出的 gp85 特异性片段进行琼脂糖凝胶电泳检测 下游引物 5-CGCTGCAGTCGTTTACGTCTTATACCTG-3 ALV-B 上游引物 5-CGCTGCAGGATGTCCACTTACTCGAGCA-3 1038bp 禽白血病病毒B亚群（ALV-B）gp85 基因片段 扩增出的 gp85 特异性片段进行琼脂糖凝胶电泳检测 下游引物 5-CCGAAGCTTTCGTTTGCGTCTTATACCTG-3 ALV-J 上游引物 5-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3 545bp 禽白血病病毒J亚群（ALV-J）gp85 基因片段 扩增出的 gp85 特异性片段进行琼脂糖凝胶电泳检测 下游引物 5-CGAACCAAAGGTAACACACG-3 REV 上游引物 F:5-CATACTGGAGCCAATGGTT-3 292bp 网状内皮增殖病病毒（REV）gp90 基因片段 扩增出的 gp90 特异性片段进行琼脂糖凝胶电泳检测 下游引物 5-AATGTTGTAGCGAAGTACT-3 DB37/T 44362021 6 B B 附录B （资料性）RT-PCR 反应条件 B.1 反转录体系为：采用 20 L 体系，在 PCR 管中依次加入 5X FastKing-RT SuperMix 4 L，模板RNA x L（x=2 000/RNA 浓度），