DB35T 2024-2021 鳗鲡疱疹病毒感染诊断技术规范.pdf

ICS 11.220 CCS B 41 35 福建省地方标准 DB35/T 20242021 鳗鲡疱疹病毒感染诊断技术规范 Protocol of diagnosis technology for Herpesvirus anguillae infection 2021-11-23 发布 2022-02-23 实施福建省市场监督管理局 发 布DB35/T 20242021 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 主要试剂和材料.1 6 主要仪器和设备.2 7 临床诊断.2 8 实验室分子诊断.2 9 综合判定.3 附录 A（资料性）试剂配制.4 附录 B（资料性）鳗鲡疱疹病毒阳性参考序列.6 DB35/T 20242021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由福建省农业科学院提出。本文件由福建省海洋与渔业局归口。本文件起草单位：福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、福建省农业科学院生物技术研究所、福州海关技术中心、清流县畜牧兽医水产中心。本文件主要起草人：饶秋华、葛均青、张志灯、罗土炎、黄文华、杨金先、刘洋、何肖云、陈强、宋铁英、罗钦、黄薇。DB35/T 20242021 1 鳗鲡疱疹病毒感染诊断技术规范 1 范围 本文件规定了日本鳗鲡（Anguilla japonica）、欧洲鳗鲡（A.anguilla）、美洲鳗鲡（A.rostrata）、花鳗鲡（A.marmorata）及太平洋双色鳗鲡（A.bicolor pacifica）的鳗鲡疱疹病毒感染诊断技术。本文件适用于鳗鲡疱疹病毒感染的诊断。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrithylammonium bromide）dATP：脱氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine triphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（Deoxycytidine triphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（Deoxyguanosine triphosphate）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（Deoxythymidine triphosphate）EB：溴化乙啶（Ethidium bromide）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid）HVA：鳗鲡疱疹病毒（Herpesvirus anguillae）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）Taq 酶：DNA 聚合酶（Thermus Aquaticus DNA Polymerase）TBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（Tris-borate-EDTA）Tris：三羟甲基氨基甲烷（Tris hydroxymethyl aminomethane）5 主要试剂和材料 5.1 水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。5.2 Taq 酶：2 U/L，20 保存。DB35/T 20242021 2 5.3 dNTP：dCTP、dGTP、dATP、dTTP，浓度为 2.5 mmol/L。5.4 引 物：上 游 引 物HVA-F：5-GTGTCGGGCCTTTGTGGTGA-3，下 游 引 物HVA-R：5-CATGCCGGGAGTCTTTTTGAT-3，引物浓度为 10 mol/L。5.5 琼脂糖：电泳级。6 主要仪器和设备 6.1 恒温培养箱：温度误差2。6.2 高速离心机：12 000 g 以上。6.3 PCR 仪。6.4 水平电泳仪。6.5 凝胶成像仪。6.6 匀浆器。7 临床诊断 7.1 体表检查 观察鱼体是否出现下列症状：体表出现黏液脱落，鳃盖、颌部、胸鳍和腹鳍等部位出现瘀血和出血，尤其头部鳃盖和颌部出血、淤血明显，体表或形成明显脱黏斑。7.2 解剖检查 解剖病鱼，观察是否出现下列症状：鳃红肿出血；肝脏肿大，有出血点和灰白色的坏死病灶；脾脏和肾脏肿大、出血；肠粘膜水肿、充血、发炎。7.3 临床判定 体表检查和解剖检查中出现以上临床症状，初步判断为疑似鳗鲡疱疹病毒感染。8 实验室分子诊断 8.1 鳗鲡疱疹病毒的 PCR 检测 8.1.1 采样 在鳗鲡的鳃、肝脏、脾脏、肾脏等部位及体表黏液，共取50 mg100 mg样品，置于1.5 mL离心管中。8.1.2 样品处理 首先加入150 L CTAB溶液（见附录A的A.1），用小剪刀将样品剪碎，再用匀浆器将样品匀浆后，再加CTAB溶液到900 L，混匀后于室温孵育2 h，4 000 g离心5 min，取上清液。8.1.3 DNA 抽提 在上述上清液中先加600 L抽提液1（见附录A的A.2），充分混合30 s，12 000 g离心5 min，取上层水相；再加700 L抽提液2（见附录A的A.3），充分混合30 s，12 000 g离心5 min，取上层水相；然后加入1.5倍体积的异丙醇，混匀后，静置5 min，12 000 g离心10 min，弃上清液；加入600 L 75%DB35/T 20242021 3 乙醇，混匀后12 000 g离心10 min，弃上清液，室温静置5 min；最后加20 L水溶解沉淀，作为PCR模板。提取步骤也可采用等效商品化组织DNA提取试剂盒提取。8.1.4 PCR 扩增 DNA 在0.2 mL离心管中加入10PCR缓冲液（见附录A的A.7）2.5 L、25 mmol/L氯化镁（MgCl2）（见附录A的A.6）1 L、dNTP 2 L、上下游引物各0.5 L、Taq酶2 U、1 L待测样品DNA为模板，补充水至总体积25 L，也可采用等效商品化试剂盒进行扩增。反应液混匀后，离心使其集中在离心管底部，将离心管置于PCR扩增仪，按照94 4 min；再94 30 s，55 30 s，72 30 s，40次循环；然后72 10 min；最后4 保温的反应条件进行PCR扩增。8.1.5 琼脂糖凝胶电泳 用TBE电泳缓冲液（见附录A的A.4）配制1%的琼脂糖含0.5 g/mL EB（见附录A的A.5）凝胶。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。取6 L PCR扩增产物和2 L电泳上样缓冲液（见附录A的A.8）混匀，加入样品孔，5 V/cm电泳约30 min，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。在凝胶成像仪下观察核酸条带并判断结果。8.1.6 设立对照 8.1.6.1 取已知鳗鲡疱疹病毒感染阳性的组织 DNA 或鳗鲡疱疹病毒阳性克隆片段 1 L 为模板，作为阳性对照。8.1.6.2 取已知鳗鲡疱疹病毒阴性的组织 DNA 1L 为模板，作为阴性对照。8.1.6.3 用 1 L 水为模板，作为空白对照。8.2 结果判定 8.2.1 PCR 扩增后，阳性对照的 PCR 产物会出现一条约 394 bp 的 DNA 条带，阴性对照和空白对照没有该条带，则实验结果成立。8.2.2 待测样品经 PCR 扩增后，电泳后出现约 394 bp 条带的判定为阳性，没有出现条带或者条带的大小不符合 394 bp 的均判定为阴性。9 综合判定 疑似鳗鲡疱疹病毒感染的样品，经PCR扩增出394 bp片段，并经测序比对分析后（见附录B），同源性大于99%，判定为鳗鲡疱疹病毒病。无临床症状和病理变化的样品，经PCR反应扩增出394 bp片段，并经测序比对分析后（见附录B），同源性大于99%，判定为携带鳗鲡疱疹病毒。DB35/T 20242021 4 A A 附录A （资料性）试剂配制 A.1 CTAB 溶液 按2%CTAB，1.4 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-HCl pH7.5配制。使用前加巯基乙醇至终浓度为0.25%。A.2 抽提液 1 三氯甲烷/异戊醇（将三氯甲烷和异戊醇按24:1的比例混合，密闭避光保存）。A.3 抽提液 2 酚/三氯甲烷/异戊醇（用1 mol/L pH（7.90.2）Tris饱和过的重蒸酚:三氯甲烷:异戊醇按25:24:1的比例混合，密闭避光保存）。A.4 TBE 电泳缓冲液（5X 浓缩液）A.4.1 成分 见表A.1。表A.1 TBE 电泳缓冲液成分 试剂名称 试剂含量 Tris 54.0 g 硼酸 27.5 g EDTA 2.9 g A.4.2 制法 将固体物质溶解于蒸馏水,将总体积调整至1 000 mL，用5 mol/L的HCl调pH至8.0。A.5 溴化乙锭（EB）用水配制成10 mg/mL的浓缩液。A.6 氯化镁（MgCl2）25 mmol/L。A.7 10PCR 缓冲液（10buffer）A.7.1 成分 见表A.2。DB35/T 20242021 5 表A.2 10PCR 缓冲液成分 试剂名称 试剂含量 Tris-HCl 7.88 g 氯化钾 3.73 g TritonX-100 1 mL A.7.2 制法 将固体物质溶解于蒸馏水,再加入1 mL TritonX-100，将总体积调整至100 mL。A.8 4电泳上样缓冲液 每100 mL溶液中含溴酚蓝0.25 g，蔗糖40 g。DB35/T 20242021 6 B B 附录B （资料性）鳗鲡疱疹病毒阳性参考序列 以下为鳗鲡疱疹病毒阳性基因序列片段。CATGCCGGGAGTCTTTTTGATCACGTCCTCCACTATAAGGATCTTTTGTCGCCCCGAGAGCGTGGTCAACATCTGACAGATGCGATCCGATACGCCGTAGTGCGAGTTGGCGCAGATCTTCATCTCGTTCTGCAGCTGGTTGAAGTATTTTTTCAGTCCGGGGCTCTTGGCCGTCTTCATGTCGCCCTTGTATTTGTTTCGCATGCTCAGGTAGTGGCGGAGGCTGGAAGACGTGTACGTCGTAAACCTGGTCCACCCGGTCTCCACACTCTTGTGTAGGAGGATGGTGTAGAGGTTCTCGGCCTCCCCGTACTCCCTATTCTCTATGAGGCCGGAGATGGCCGGCATTCTTTTCCAATCCAACACCACCTTGTTCACCACAAAGGCCCGACAC