DB35T 1984-2021 水产品乙酰甲喹及其主要代谢物鉴别技术规程.pdf

ICS 67.120.30 CCS B 50 35 福建省地方标准 DB35/T 19842021 水产品乙酰甲喹及其主要代谢物鉴别技术规程 Specifications of identification techniques of mequindox and its main metabolites in fishery products 2021-06-21 发布 2021-09-21 实施福建省市场监督管理局 发 布DB35/T 19842021 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 原理.1 5 试剂和材料.1 6 仪器和设备.2 7 分析步骤.2 8 结果计算与表示.4 9 回收率、重现性、再现性和灵敏度.4 附录 A（资料性）色谱图示例.5 附录 B（资料性）回收率试验研究结果.7 DB35/T 19842021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由福建省农业科学院提出。本文件由福建省海洋与渔业局归口。本文件起草单位：福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、厦门瑞德利校准检测技术有限公司、福建赛福食品检测研究所有限公司。本文件主要起草人：潘葳、刘文静、罗钦、丁亚闽、郭娇娇、傅建炜。DB35/T 19842021 1 水产品乙酰甲喹及其主要代谢物鉴别技术规程 1 范围 本文件规定了水产品中乙酰甲喹及其5种主要代谢物鉴定的原理、试剂和材料、仪器和设备、分析步骤、结果计算与表示以及回收率、重现性和再现性。本文件适用于水产品中乙酰甲喹（MEQ）及其5种主要代谢物3-甲基-2-（1-羟基）乙基-喹噁啉-Nl，N4-二氧化物（M1）、3-甲基-2-（1-羟基）乙基-喹噁啉-N4-一氧化物（M2）、3-甲基-2-乙酰基-喹噁啉-N4-一氧化物（M3）、3-甲基-2-乙酰基-喹噁啉（M4）和3-甲基-2-（1-羟基）乙基-喹噁啉（M10）残留量的鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 308912014 水产品中抽样规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理 用二氯甲烷和乙酸乙酯混合液提取试样中的乙酰甲喹及其代谢物，提取液旋转蒸发至近干，用甲醇-水流动相涡旋溶解残渣，用正己烷去除其中的脂肪，溶解液经微孔滤膜过滤，高效液相色谱-紫外检测法测定，外标法定量。5 试剂和材料 除另有规定，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 66822008中一级水规定，具体试剂与材料如下：二氯甲烷（CH2Cl2）；乙酸乙酯（C4H8O2）；甲醇（CH4O）：色谱纯；正己烷（C6H14）；二氯甲烷-乙酸乙酯混合提取液（75+25，体积比）：将 75 体积二氯甲烷与 25 体积乙酸乙酯混合；标准溶液配制及样品前处理所用流动相：将 38 体积甲醇与 62 体积一级水混合；乙酰甲喹 MEQ 标准品（Mequindox，C11H10N2O3，纯度99.0%）；DB35/T 19842021 2 乙酰甲喹代谢物 M1 标准品（2-isoethanol mequinoox，C11H12N2O3，纯度99.0%）；乙酰甲喹代谢物 M2 标准品（2-isoethanol-1-desoxymequindox，C11H12N2O2，纯度99.0%）；乙酰甲喹代谢物 M3 标准品（1-desoxymequindox，C11H10N2O2，纯度99.0%）；乙酰甲喹代谢物 M4 标准品（bisdesoxymequindox，C11H10N2O，纯度99.0%）；乙酰甲喹代谢物 M10 标准品（2-isoethanol bisdesoxymequindox，C11H12N2O，纯度99.0%）；乙酰甲喹及 5 种代谢物标准储备液：准确称取适量乙酰甲喹、乙酰甲喹代谢物 M1、M2、M3、M4、M10 标准品（精确至 0.1 mg），分别置于 6 个 100 mL 容量瓶中，用甲醇分别溶解并定容至刻度，配制成浓度均为 100 g/mL 的 6 种不同化合物的标准贮备液，4 8 保存，有效期 2 个月；乙酰甲喹及 5 种代谢物混合标准中间液：分别准确移取 1.00 mL 以上乙酰甲喹及 5 种代谢物标准储备液于同一 10 mL 容量瓶中，用体积比为 38+62 的甲醇-水流动相溶液稀释并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为 10 g/mL 的 6 种不同化合物的混合标准中间液，即配即用；乙酰甲喹及 5 种代谢物混合标准工作液：分别准确移取 0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL 以上乙酰甲喹及 5 种代谢物混合标准中间液于不同的 50 mL 容量瓶中，用体积比为38+62 的甲醇-水流动相溶液稀释并定容至刻度，摇匀，得到不同浓度的乙酰甲喹及代谢物混合标准工作溶液（质量浓度分别为 0.05 g/mL、0.10 g/mL、0.20 g/mL、0.50 g/mL、1.00 g/mL），即配即用；水相微孔滤膜：0.22 m。6 仪器和设备 高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。组织捣碎机：转速 12 000 r/min。离心管：50 mL（螺旋盖），10 mL（具塞）。离心机：50 mL，10 mL，转速不低于 4 000 r/min。均质器：功率不低于 500 W。电子天平：感量 0.1 mg，0.01 g。涡旋混合器。超声波清洗器：功率不低于 250 W。旋转蒸发仪。7 分析步骤 样品前处理 7.1.1 试样制备 按照GB/T 308912014附录B的规定，取可食部分用组织捣碎机（6.2）匀浆，备用。如不能及时检测，应在-18 以下保存备用。7.1.2 提取 称取匀浆后的样品5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加20 mL二氯甲烷-乙酸乙酯混合提取液，振摇混匀，用均质器均质，再超声提取15 min，4 000 r/min离心10 min，将提取液移至100 mL鸡心瓶DB35/T 19842021 3 中。残渣再用20 mL二氯甲烷-乙酸乙酯混合提取液重复以上萃取和离心步骤，合并上清液于鸡心瓶中，40 旋转蒸发至近干。7.1.3 净化 向蒸发近干的鸡心瓶中准确加入1.00 mL体积比为38+62的甲醇-水流动相、5 mL正己烷 涡 旋 混 合1 min溶解残渣，转移至10 mL具塞离心管中，4 000 r/min离心10 min，弃去上层正己烷，下层溶液过0.22 m微孔滤膜后，供液相色谱分析。样品测定 7.2.1 高效液相色谱参考条件 以下分析条件可供参考，采用其它条件应验证其适用性：色谱柱：C18，150 mm4.6 mm i.d.，粒径 3 m，或性能相当者；柱温：35；紫外检测波长：240 nm；进样体积：10 L；流速：0.8 mL/min；流动相：梯度洗脱。流动相及梯度洗脱条件见表 1。表1 流动相及梯度洗脱条件 时间 min 流动相 A（超纯水）%流动相 B（甲醇）%0.00 62.0 38.0 8.00 62.0 38.0 11.00 30.0 70.0 17.00 30.0 70.0 18.00 62.0 38.0 22.00 62.0 38.0 7.2.2 液相色谱测定 7.2.2.1 分别取适量的乙酰甲喹及 5 种代谢物混合标准工作溶液及待测样液，按 7.2.1 列出的条件进行液相色谱分析测定。由保留时间进行定性，外标法定量，根据混合标准工作溶液的浓度及乙酰甲喹及5 种代谢物响应峰面积，建立标准工作曲线。工作曲线线性相关系数 R20.99。7.2.2.2 待测样液中乙酰甲喹及 5 种代谢物的响应值应在标准曲线范围内，超过线性范围则应稀释后再进行分析。分析间每 20 次样品测定后应加入一个与样品峰面积相近的标准工作液，如果测得的值与原值相对平均偏差超过 5%，则应重新进行标准曲线的制作。标准样品及典型样品色谱图参见附录 A。DB35/T 19842021 4 8 结果计算与表示 结果计算 试样中乙酰甲喹及其代谢物的含量按式（1）进行计算：mfVcX （1）式中：X试样中乙酰甲喹及代谢物的含量（以质量分数计），单位为毫克每千克（mg/kg）；c由标准工作曲线得出的乙酰甲喹及代谢物浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；V试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；f试样稀释倍数；m试样质量，单位为克（g）。结果表示 8.2.1 测定结果以平行测定的算术平均值表示。8.2.2 测定结果1 mg/kg 时，结果保留 3 位有效数字。8.2.3 测定结果1 mg/kg 时，有效数字保留到小数点后第 3 位。9 回收率、重现性、再现性和灵敏度 回收率 回收率试验结果参见附录B。重复性 9.2.1 0.003 mg/kg被测组分含量0.01 mg/kg 时，精密度 RSD 应32%。9.2.2 0.01 mg/kg被测组分含量0.1 mg/kg 时，精密度 RSD 应22%。9.2.3 0.1 mg/kg被测组分含量1.0 mg/kg 时，精密度 RSD 应18%。9.2.4 被测组分含量1.0 mg/kg 时，精密度 RSD 应14%。再现性 9.3.1 0.003 mg/kg被测组分含量0.01 mg/kg 时，精密度 RSD 应46%。9.3.2 0.01 mg/kg被测组分含量0.1 mg/kg 时，精密度 RSD 应34%。9.3.3 0.1 mg/kg被测组分含量1.0 mg/kg 时，精密度 RSD 应25%。9.3.4 被测组分含量1.0 mg/kg 时，精密度 RSD 应19%。灵敏度 本文件测定水产品中乙酰甲喹及其5种主要代谢物残留量的检出限均为0.003 mg/kg，定量限均为0.010 mg/kg。DB35/T 19842021 5 A A 附录A （资料性）色谱图示例 色谱图示例参见图A.1图A.5。图A.1 标准溶液色谱图 图A.2 虾肉试样色谱图 图A.3 青蛤肉试样色谱图 M1MEQM2M10M3M4AU0.000.100.200.300.400.50min2.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.00M1MEQM2M10M3AU-0.100.000.100.200.300.400.500.600.70min2.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.00M1MEQM2M10M3M4AU0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.030min2.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.00DB35/T 19842021 6 图A.4 蟹肌肉试样色谱图 图A.5 鳗鲡肌肉试样色谱图 M1MEQM2M10M3AU0.000.100.200.300.400.500.600.70min2.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.00M1MEQM2M10M3M4AU0.000.020.040.060.080.100.120.14min0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.00DB35/T 19842021 7 B B 附录B （资料性）回收率试验研究结果 回收率研究结果见表B.1。表B.1 回收率研究结果 样品基质 添加水平（mg/