DB37T 2843-2016 鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 28432016 鸭坦布苏病毒双抗体夹心 ELISA 检测方法 Detection method on Duck Tembusu Virus by a double antibody sandwich ELISA 2016-09-18 发布 2016-10-18 实施山东省质量技术监督局 发 布 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 28432016 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、陈浩、唐熠、提金凤、冯强、欧全宾。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 28432016 1 鸭坦布苏病毒双抗体夹心 ELISA 检测方法 1 范围 本标准规定了鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA方法的样品采集和保存、样品处理、试剂及仪器、检测步骤、结果判定等。本标准所规定的鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA方法适用于检测鸭组织、分泌物、排泄物和鸭胚尿囊液中的坦布苏病毒，也适用于鹅和其他动物坦布苏病毒的检测。2 试剂及仪器 2.1 试剂 2.1.1 捕获单抗，抗坦布苏病毒 E 蛋白单克隆抗体。2.1.2 检测单抗，辣根过氧化物酶标记（HRP）的另一株抗坦布苏病毒 E 蛋白单克隆抗体，简称酶标单抗。2.1.3 阳性对照：坦布苏病毒鸭胚尿囊液。2.1.4 阴性对照：SPF 鸭胚尿囊液。2.1.5 磷酸盐缓冲液（PBS），见 A.1。2.1.6 包被液，见 A.2。2.1.7 洗涤液，见 A.3。2.1.8 样品稀释液、封闭液，见 A.4。2.1.9 底物溶液，商品化 TMB 底物显色液。2.1.10 终止液，见 A.5。2.1.11 甘油盐水，见 A.6。2.2 仪器 2.2.1 酶标仪。2.2.2 微量加样器。2.2.3 恒温培养箱。2.2.4 聚苯乙烯板。2.2.5 水平振荡器。2.2.6 生物安全柜。3 样品准备 3.1 样品的采集和处理 3.1.1 样品的采集 死亡鸭采集卵泡膜、脾和脑等组织样品，进行分别处理或同时处理；活鸭采集咽喉或泄殖腔拭子。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 28432016 2 3.1.2 样品的保存 样品应放在含有抗生素的pH值7.07.4的等渗磷酸盐缓冲液内（无PBS可用25%50%甘油盐水）。抗生素的选择视当地情况而定，组织和咽喉拭子悬液中应含有青霉素(2000 IU/mL)、链霉素(2 mg/mL)、庆大霉素(50 g/mL)和制霉菌素(1000 IU/mL)，加入抗生素后pH值应调至7.07.4。在室温放置1 h2 h内样品应尽快处理。不能尽快处理的可在4 存放24 h，也可于低温条件下保存(-70 贮存最好)。3.1.3 样品的处理 样品的处理在生物安全柜中进行。喉头或泄殖腔拭子，置于200 L含有抗生素的pH值7.07.4等渗磷酸盐缓冲液中；对组织样品取0.2 g置于500 L含有抗生素的pH值7.07.4等渗磷酸盐缓冲液中研磨，反复冻融3次；8000 r/min离心5 min，取上清作为检测材料。4 操作步骤 4.1 试验试剂预温到 20 25。4.2 将捕获单抗用包被液稀释成 2.5 ng/L，每孔 100 L 加入 96 孔聚苯乙烯板中，4 孵育过夜。4.3 用洗涤液 100 L 洗 3 次，每次置于水平振荡器 300 r/min 震荡 3 min，甩干板上残余液体。4.4 每孔加入 200 L 封闭液，恒温培养箱 37 孵育 1 h，用 4.3 方法洗板。4.5 在 A1、A2 孔各加 100 L 阴性对照，A3、A4 孔各加 100 L 阳性对照。4.6 将待检样品加入其他各孔，每孔 100 L，恒温培养箱 37 孵育 1 h，用 4.3 方法洗板。4.7 将酶标单抗用样品稀释液按 1:1000 倍稀释，每孔加 100 L，37 孵育 1 h，用 4.2 方法洗板。4.8 每孔加 100 L 底物溶液，37 避光孵育 15 min。4.9 每孔加入 50 L 终止液，轻轻振荡，终止反应。4.10 置酶标仪于 450 nm 测定各孔吸光度（OD）值，该操作需 30 min 内完成。5 结果判定 5.1 阴性对照 OD 均值等于（A1 孔 OD 值+A2 孔 OD 值）/2；阳性对照 OD 均值等于（A3 孔 OD 值+A4 孔OD 值）/2。5.2 阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差须大于 0.4；阴性对照平均值须小于等于 0.20。试验条件成立，否则重做。5.3 判定：5.3.1 阳性 样品液 OD450nm0.40，判断为阳性，即待检样品中含有坦布苏病毒。5.3.2 阴性 样品液 OD450nm0.20，判断为阴性，即待检样品中不含有坦布苏病毒。5.3.3 样品 样品液 0.20OD450nm0.40，判断为可疑，需要重做。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 28432016 3 A A 附 录 A（规范性附录）试剂配制 A.1 磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L pH 7.4）NaCl 8.0g KCl 0.2g KH2PO4 0.2g Na2HPO412H2O 0.2g 蒸馏水加至 1000 mL A.2 包被液（0.05 mol/L p H9.6）Na2CO3 0.2756 g NaHCO3 0.6216 g 蒸馏水加至 100 mL A.3 洗涤液 PBS 1000 mL Tween-20 0.5 mL A.4 样品稀释液（封闭液）脱脂奶粉 5.0 g 洗涤液 100 mL A.5 终止液 H2SO4（98%）58 mL 蒸馏水 442 mL A.6 50%甘油盐水 甘油 50 mL NaCl 0.9 g 蒸馏水加至 100 mL _ 山东省地方标准公开山东省地方标准公开