DB34T 3284-2018 猪丹毒丝菌实时荧光 PCR检测方法.pdf

ICS 11.220B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 32842018猪丹毒丝菌实时荧光 PCR 检测方法 Method of the real-time PCR for the detection of Erysipelothrix rhusiopathiae 文稿版次选择 2018-12-29 发布2019-01-29 实施安徽省市场监督管理局 发 布DB34/T 32842018I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽农业大学提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司、安徽省动物卫生监督所、巢湖市畜牧兽医局、阜阳市动物卫生监督所、合肥市动物疫病预防与控制中心、安徽省兽药饲料监察所，同济大学。本标准主要起草人：李郁、李雪松、李春芬、张利亚、陈章、黄晓慧、孙裴、姚焱彬、张劲松、高亚飞、孟天恺。DB34/T 328420181 猪丹毒丝菌实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪丹毒丝菌实时荧光 PCR 检测方法的缩略语、试剂和仪器、样品的采集、运输与保存、操作方法。本标准适用于猪组织样品、血样及其细菌培养物中猪丹毒丝菌的实时荧光 PCR 检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。荧光 PCR：荧光聚合酶链式反应 Ct 值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数 DNA：脱氧核糖核酸 Taq 酶：Taq DNA 聚合酶 PBS：磷酸盐缓冲液 Eppendorf 管：微量离心管 4 试剂和仪器 4.1 试剂 4.1.1 无水乙醇:-20预冷。4.1.2 75乙醇:用新开启的无水乙醇和无 DNA 酶的灭菌双蒸水配制，-20预冷。4.1.3 灭菌双蒸水。4.1.4 动物组织基因组 DNA 提取试剂盒。4.1.5 引物：上游引物：5-GTGGCGCATATAATCCCGTA-3 下游引物：5-GCAAACGCAATGGCTTCT-3 4.1.6 2TransTaq-T PCR SuperMix。4.1.7 Taq 酶。4.1.8 实验用水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。4.2 仪器 DB34/T 328420182 4.2.1 显微镜：物镜 10 倍100 倍。4.2.2 电子天平：感量 0.1 g。4.2.3 恒温培养箱：3614.2.4 冰箱：（28，-20，-80）。4.2.5 微量移液器：0.1 L2.5 L、0.5 L10 L、5 L50 L、20 L200 L、100 L1 000 L。4.2.6 荧光 PCR 仪。4.2.7 恒温水浴锅（室温至 100）。4.2.8 高速台式冷冻离心机：最大转速 14 000 r/min 以上。4.2.9 全自动快速样品研磨仪。4.2.10 混匀器 5 样品的采集、运输与保存 5.1 采样要求 采样过程中样品不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。5.2 采样工具 5.2.1 剪刀、镊子、注射器、1.5 mL Eppendorf 管。5.2.2 所有上述采样工具必须经(121 士 2)，15 min 高压灭菌并烘干。5.3 样品的采集 5.3.1 组织器官 根据临床症状的不同采集典型病料。用剪刀、镊子无菌采集肾、脾、肝、心血、淋巴结、疹块及其周围皮肤、肿胀的关节液、心脏瓣膜增生物等。5.3.2 血清或全血 用无菌注射器直接吸取至无菌 Eppendorf 管，分离血清。或用加有抗凝剂的注射器直接吸取至无菌 Eppendorf 管，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或 0.5 mol/L EDTA。每 6 mL 血液加 1 mL抗凝剂。5.3.3 细菌培养物 直接取液体培养基培养的菌液。对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量菌样，放入 0.01 mol/L pH 7.6 PBS 中，振荡混匀形成悬浮菌液。5.4 样品的运输与保存 采集的样品应置于低温、密封的容器内运输。待检样品在 28条件下保存不应超过 24 h；若不能在规定时间内送检的，可保存于饱和氯化钠溶液或 30甘油缓冲盐水溶液中，但保存不应超过 72 h。6 操作方法 DB34/T 328420183 6.1 样品前处理 6.1.1 组织器官样品前处理 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 10 mg 于研钵中充分研磨，再加 5.0 mL 0.01 mol/L pH 7.6 PBS 混匀，然后将组织悬液转入无菌 1.5 mL Eppendorf 管中，编号备用。6.1.2 血样、细菌培养物前处理 取 1 mL2 mL 全血样品，12000g 离心 10 min，弃上清；加等体积灭菌双蒸水充分混匀，12000g离心 10 min,弃上清，若红细胞裂解不完全，出现红色沉淀物，则需采用灭菌双蒸水重复洗涤；收集沉淀物，-20贮存备用。取 1 mL2 mL 血清、细菌培养物，12000g 离心 10 min，弃上清；加 1 mL 0.01 mol/L pH 7.6 PBS，充分振荡混匀，12000g 离心 10 min，弃上清，收集沉淀物，-20贮存备用。6.2 核酸（DNA）提取 按照动物组织基因组 DNA 提取试剂盒说明书进行。6.3 DNA 提取后的处理要求 提取后的 DNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增或置于-80贮存备用。6.4 荧光 PCR 扩增反应 6.4.1 对照设立 从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照：阳性对照：取扩增基因的阳性克隆分子 DNA 或阳性标准菌株 DNA 作为阳性对照。阴性对照：取无交叉反应的非阳性菌株 DNA 作为阴性对照。空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。6.4.2 扩增试剂准备 采用反应体系体积为 20 L，含以下成分：2SYBR Premix Taq II 10 L，dd H2O 6.8 L，上游引物（10 mol/L）和下游引物（10 mol/L）各 0.4 L，50ROX Reference Dye 0.4 L，DNA 模板 2 L。根据上述反应体系、按每个反应 18 L 的用量配制荧光 PCR 预混反应液，不足部分加灭菌双蒸水补足。将各试剂按使用量吸取到 1.5 mL Eppendorf 管中，充分混匀，然后在每个 PCR 光学管中分装 18 L。6.4.3 加 DNA 模板 在样品处理区进行。在已分装有荧光 PCR 预混反应液的 PCR 光学管中每管分别加入 2 L 样品或对照的 DNA 模板，混匀，盖上管盖，放入荧光 PCR 仪，记录样品放置顺序。6.4.4 荧光 PCR 扩增检测 在扩增检测区进行。将 6.4.3 中加 DNA 模板后的 PCR 管放入荧光定量 PCR 检测仪内，记录样品摆放顺序。反应参数设置：DB34/T 328420184 第一阶段：95 5 min，1 个循环；第二阶段：95 10 s，61 60 s,40 个循环，荧光收集设置在 61退火延伸时进行；第三阶段：55 30 s，95 30 s，1 个循环。6.5 结果判定 见附录B。DB34/T 328420185 A A 附 录 A（规范性附录）缓冲液的配制 A.1 柠檬酸钠缓冲液A.1.1 成分柠檬酸5.3 g 柠檬酸钠15 g 葡萄糖16.2 g 蒸馏水1 LA.1.2 制法将 A.4.1 中各成分溶解于蒸馏水，定容至 1 L，混匀。121高压灭菌 15 min 后储存于 4备用。A.2 0.5 mol/L EDTA 缓冲液（pH 8.0）A.2.1 成分EDTA 186.1 g 蒸馏水1 L A.2.2 制法称取 186.1 g EDTA 溶解于蒸馏水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，校正 pH 至 8.0，定容至 1 L，分装，121高压灭菌 15 min 后储存于室温备用。A.3 0.01 mol/L pH 7.6 PBSA.3.1 成分氯化钠4 g 十二水合磷酸氢二钠 1.5 g 氯化钾0.1 g 磷酸二氢钾0.1 g 蒸馏水500 mL A.3.2 制法将 A.2.1 中各成分溶解于蒸馏水中，定容至 500 mL，校正 pH 至 7.6，121灭菌 20 min 备用。A.4 饱和氯化钠溶液DB34/T 328420186 A.4.1 成分氯化钠 380390 g 蒸馏水1 L A.4.2 制法称取 380390 g 氯化钠溶于蒸馏水中，定容至 1 L。分装于灭菌广口瓶中，每瓶 200 mL，121高压灭菌 15 min 备用。A.5 30甘油缓冲盐水溶液A.5.1 成分氯化钠5 g 碱性磷酸钠10 g 中性甘油 300 mL 蒸馏水1 L A.5.2 制法先将氯化钠和碱性磷酸钠溶解于蒸馏水中，然后加入中性甘油，混匀，分装于灭菌广口瓶中，每瓶200 mL，121高压灭菌 15 min 备用。DB34/T 328420187 B B 附 录 B（规范性附录）猪丹毒丝菌荧光定量 PCR 检测结果判定 B.1 结果判定B.1.1 结果分析条件设定B.1.1.1 读取检测结果。B.1.1.2 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。B.1.2 质控标准B.1.2.1 空白对照：无 Ct 值并无明显的扩增曲线和溶解曲线。B.1.2.2 阴性对照：无 Ct 值并无明显的扩增曲线和溶解曲线。B.1.2.3 阳性对照：Ct 值30 并出现特异的扩增曲线和较为一致的溶解曲线。B.1.3 结果描述及判定B.1.3.1 阴性反应结果判定：检测结果呈现无 Ct 值并无明显的扩增曲线和溶解曲线，判为荧光 PCR阴性反应，样品判为猪丹毒丝菌核酸检测阴性。B.1.3.2 阳性反应结果判定：检测结果呈现 Ct 值30 并出现特异的扩增曲线和较为一致的溶解曲线，判为荧光 PCR 阳性反应，样品判为猪丹毒丝菌核酸检测阳性。B.1.3.3 对于 30Ct 值35 的样品，需重新取样进行重复扩增。如果重复测结果的 Ct值35，且出现特异的扩增曲线和较为一致的溶解曲线，判为阳性反应。否则判为荧光 PCR 阴性反应。B.1.3.4 必要时，对初次检测呈荧光 PCR 阳性反应的样品进行重复检测。B.1.3.5 猪丹毒丝菌实时荧光定量 PCR 具体检测结果判定见图B.1。DB34/T 328420188 图B.1 猪丹毒丝菌实时荧光定量 PCR 检测结果 _