DB35T 1872-2019 鸭3型腺病毒病诊断技术.pdf

ICS 11.220B 41 DB35 福建省地方标准 DB35/T 18722019鸭 3 型腺病毒病诊断技术 Diagnostic technique for duck adenovirus 3 infection 2019-12-19 发布 2020-03-19 实施 福建省市场监督管理局 发 布DB35/T 18722019 I 目 次 前言.II1 范围.12 缩略语.13 疫病概述.14 临床诊断.15 PCR 诊断.16 结果判定.3附录 A（规范性附录）试剂的配制.4附录 B（资料性附录）PCR 检测结果电泳图.6附录 C（资料性附录）参考序列.7DB35/T 18722019II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由福建省农业科学院提出。本标准由福建省农业农村厅归口。本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：万春和、黄瑜、傅光华、李中华、程龙飞、刘荣昌、施少华、陈翠腾、陈红梅、傅秋玲、陈珍、朱春华。DB35/T 18722019 1 鸭 3 型腺病毒病诊断技术 1 范围 本标准规定了鸭3型腺病毒病的临床诊断、PCR诊断和结果判定。本标准适用于鸭3型腺病毒病的临床诊断、实验室诊断和流行病学调查。2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。DAdV-3：鸭3型腺病毒（Duck Adenovirus 3）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline）Tris：三羟甲基氨基甲烷（Trihydroxymethyl Aminomethane）3 疫病概述 根据国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy of Viruses）的最新分类：腺病毒科（Adenoviridae）下设5个属，分别为富AT腺病毒属（Atadenovirus）、禽腺病毒属（Aviadenovirus）、鱼腺病毒属（Ichtadenovirus）、哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）和唾液酸酶腺病毒属（Siadenovirus）。鸭3型腺病毒病主要发生于40日龄内雏番鸭，临床表现为肝脏肿大、出血，脾脏肿大，胆囊肿大，肾脏肿大、出血。流行病学调查表明，该病发病率20%50%，病死率60%70%。4 临床诊断 4.1 剖检病变 当鸭出现以下肉眼可见病变时，可作为初步诊断的依据之一：a)肝脏肿大，表面呈点状或斑状出血；b)脾脏肿大；c)胆囊肿大；d)肾脏肿大，表面出血。4.2 初步诊断 当鸭出现4.1中剖检病变之一时，可做出初步诊断；确诊需进行实验室诊断。5 PCR 诊断 5.1 主要仪器设备 主要仪器设备如下：DB35/T 187220192 a)PCR 仪；b)高速台式冷冻离心机；c)微量移液器；d)组织匀浆器；e)电泳仪；f)电泳槽；g)紫外凝胶成像系统。5.2 试剂 主要试剂如下：a)10%十二烷基硫酸钠（配置方法按照附录 A 中 A.1 的规定）；b)蛋白酶 K（10 mg/mL）（配置方法按照附录 A 中 A.2 的规定）；c)异丙醇；d)Tris饱和酚；e)酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1）；f)乙酸钠（3 mol/L，pH5.4）；g)无水乙醇；h)75%乙醇（配置方法按照附录 A 中 A.3 的规定）；i)核糖核酸酶（20 mg/mL）；j)灭菌双蒸水；k)PBS（0.01 M）（配置方法按照附录 A 中 A.4 的规定）。5.3 引物 根据DAdV-3的Fiber 2基因设计特异性引物，序列如下：上游引物DAdV-3F：5-ACACTAGACAACGGAGGCCT-3。下游引物DAdV-3R：5-AATCTTGATACGTAATCATACACA-3。预期目的片段大小为548 bp。5.4 核酸 DNA 提取 5.4.1 酚氯仿法提取核酸 DNA 5.4.1.1 取 2 g 组织（肝脏、脾脏、肾脏或三者混合物），加入 6 mL PBS（0.01M）进行研磨处理，反复冻融 3 次，4 000 r/min 离心 15 min，小心吸取上层水相作为组织匀浆液。5.4.1.2 取420 L组织匀浆液和30 L核糖核酸酶加入1.5 mL灭菌离心管混匀后，室温作用20 min。5.4.1.3 加入 40 L 10%的十二烷基磺酸钠溶液和 10 L 蛋白酶 K 溶液，56 水浴 2 h。5.4.1.4 加入等量的 Tris饱和酚，颠倒充分混匀，12 000 r/min 离心 5 min，小心吸取上层水相于另一 1.5 mL 灭菌离心管中。5.4.1.5 加入等量的酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1），颠倒充分混匀，12 000 r/min 离心 5 min，小心吸取上层水相于另一 1.5 mL 灭菌离心管中。5.4.1.6 加入1/10体积的乙酸钠和2倍体积冰冻预冷的无水乙醇混匀后，-20 放置1 h。12 000 r/min离心 15 min，去上清。加入 600 L 冰冻预冷的 75%乙醇清洗 2 次，倒置于吸水纸上 5 min，室温晾干。加入 20 L 灭菌双蒸水溶解沉淀，-20 放置备用。DB35/T 18722019 3 5.4.2 试剂盒法提取核酸 DNA 可采用市售商品化的等效核酸DNA提取试剂盒，按照说明书完成核酸DNA提取。5.5 对照 以纯化的DAdV-3基因组DNA为阳性对照；以灭活的其他鸭源病毒基因组DNA为阴性对照；以灭菌双蒸水为空白对照。5.6 PCR 扩增 5.6.1 PCR 反应体系为 50 L，每个反应管的反应液配置为：依次加入 5 L 10PCR 缓冲液，1 L上/下游引物（引物浓度均为 20 M）、4 L dNTP Mixture（各 2.5 mM）、2 L 提取的基因组 DNA、36.5 L 灭菌双蒸水、0.5 L Taq聚合酶。2 000 r/min 离心 15 s。将上述反应混合液按照以下步骤进行 PCR 扩增，94 预变性 5 min；循环参数为 94 变性 50 s，55 退火 30 s，72 延伸 35 s，循环 35 次；第三步 72 再延伸 10 min 结束。5.6.2 也可采用市售商品化的等效 PCR 预混液检测试剂盒，并按照市售商品化的试剂盒推荐的条件进行。5.7 PCR 产物电泳 PCR扩增反应结束后，PCR反应管在电泳鉴定前可置于2 8 冰箱保存。分别取5 L PCR扩增产物与0.5 L 10加样缓冲液（配置方法按照附录A中A.5的规定）混合，然后加入到1.0%琼脂糖凝胶（配置方法按照附录A中A.6的规定）板的加样孔中，加上DNA分子量标准5 L，以5 V/cm的电压进行电泳，30 min后在紫外凝胶成像系统观察结果。6 结果判定 6.1 实验成立的条件 当阳性对照出现约548 bp的特异性条带（参见附录B图B.1中1号泳道）、阴性对照无扩增条带（参见附录B图B.1中2号泳道），空白对照无扩增条带（参见附录B图B.1中3号泳道），实验结果成立。6.2 实验结果判定 当待检样品出现约548 bp条带（参见附录B图B.1中4号泳道），可判定为阳性；当待检样品无特异性扩增条带（参见附录B图B.1中5号泳道）判为阴性。必要时，将目的条带进行胶回收后克隆测序，待测样品的测序结果和参考序列（参见附录C）进行核苷酸同源性比较，同源性在98.0%以上判为阳性。DB35/T 187220194 A A 附 录 A（规范性附录）试剂的配制 A.1 10%十二烷基硫酸钠将10 g十二烷基硫酸钠溶于80 mL灭菌双蒸水中，调节溶液的pH值至7.2，定容至100 mL，室温保存备用。A.2 蛋白酶K（10 mg/mL）将蛋白酶K（20 mg/mL）和灭菌水按照体积比1:1配置，使用前现用现配。A.3 75%乙醇取无水乙醇750 mL加入灭菌双蒸水250 mL，定容至1 000 mL，-20 保存备用。A.4 PBS（0.01 M）NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO412H2O 2.9 g KH2PO4 0.2 g 将上述试剂溶于800 mL灭菌双蒸水中，定容至1 000 mL，1.034105 Pa高压灭菌30 min，4 保存备用。A.5 10加样缓冲液聚蔗糖 25 g 溴酚蓝 0.1 g 二甲苯青 0.1 g 灭菌双蒸水 定容至100 mL A.6 1.0%琼脂糖凝胶琼脂糖 1.0 g 1TAE电泳缓冲液（配制方法按照A.7的规定）定容至100 mL 置微波炉中加热至完全融化，待冷至50 60 时，加溴化乙锭溶液（配制方法按照A.8的规定）5 L，摇匀后倒入制胶板中，待完全凝固后取下加样梳，备用。DB35/T 18722019 5 A.7 1TAE电泳缓冲液50TAE电泳缓冲液（配制方法按照A.9的规定）20 mL 灭菌双蒸水 定容至1 000 mL。A.8 溴化乙锭溶液溴化乙锭 20 mg 灭菌双蒸水 定容至20 mL 说明：也可采用市售商品化的更环保、更安全Goldviewer等荧光染料。A.9 50TAE电泳缓冲液Tris 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100 mL 灭菌双蒸水 定容至1 000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释50倍使用。DB35/T 187220196 B B 附 录 B（资料性附录）PCR 检测结果电泳图 PCR检测结果电泳图如图B.1所示。说明：MDNA分子量标准；1阳性对照（鸭3型腺病毒）；2阴性对照（灭活的其他鸭源病毒）；3空白对照；4待检样品（鸭3型腺病毒阳性）；5待检样品（阴性）。图B.1 PCR 检测结果电泳图 M 1 2 3 4 5 bp 2000 1000 750 500 250 100 bp 548 DB35/T 18722019 7 C C 附 录 C（资料性附录）参考序列 鸭3型腺病毒参考序列：ACACTAGACAACGGAGGCCTCGACCTCAAGGTGGACCCAGGAAGCCTGGCCGTCACTGACAATACCCTACACCTCACAAGCTCATACTCAACCTATGTCTTTACGAGTGGATCTGACACACTTCAGAAGACACAAGCCCAAGTGTGCTGCGGAGCAGGGTCTGTTACGTTTCCGTGCGCATACTATGCCAAGATCGTATGCTCAAACAATGTGTCTTCAGGATATATAACACTGAAGGTGAGCGCTGAGGATGCATCACATGCTGTAGATCAACGCTTCGCGACTATTCAACCAGTATTCACATTCTGGTTATGTCGAGACATAGGTAATGAAAACACCGTCAATTTTTCCCACTGTACCAACAACAGTTATAAGCCAGAGGAAACCGCAGTCGTTAAGGCATGCATCACACCAGCATACAAAAATTTTGATGTCAGCAATGTTTCAGAACATGACTTTATTCTGTATAACTATAGTGGGGTAAACACATCAGGAGTTCCAATAGGCACAGGGAACCTAAAGAATGTGTATGATTACGTATCAAGATT _ DB35/T 18722019福建省地方标准鸭 3 型腺病毒病诊断技术DB35/T 18722019*2019 年 12 月第一版2019 年 12 月第一次印刷