DB34T 4223-2022 黄缘闭壳龟.pdf

ICS 65.150 CCS B 50 34 安徽省地方标准 DB34/T 42232022 黄缘闭壳龟 Yellow-margined Box Turtle 2022-06-29 发布 2022-07-29 实施 安徽省市场监督管理局 发 布 DB34/T 42232022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由合肥市畜牧水产技术推广中心提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：合肥市畜牧水产技术推广中心、安徽农业大学、安徽绿丰园特种养殖有限公司、安徽杰与祥水产养殖有限公司、安徽蓝田农业集团有限公司、安徽省长江水生动物保护研究中心、安徽省水产技术推广总站、肥东县水产技术推广站。本文件主要起草人：赖年悦、苏时萍、荣朝振、张万香、宋啸帆、李西雷、王孝政、项旭东、贾正增、方国侠、沈保平、高凌、徐丽、彭步旭、鲍鸣、张四刚、江孝八。DB34/T 42232022 1 黄缘闭壳龟 1 范围 本文件给出了黄缘闭壳龟（Cuora flavomarginata Gray，1863）的名称与分类、主要形态构造特征、生长和繁殖特性、遗传学特征、检测方法和判定规则。本文件适用于黄缘闭壳龟的种质检测与鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分 抽样方法 GB/T 18654.12 养殖鱼类种质检验 第12部分 染色体组型分析 GB/T 18654.15 养殖鱼类种质检验 第15部分 RAPD分析 GB/T 34727 龟类种质测定 3 术语和定义 GB/T 34727 界定的术语和定义适用于本文件。4 名称与分类 学名 黄缘闭壳龟（Cuora flavomarginata Gray，1863）。别名 夹板龟、克蛇龟、断板龟、黄缘盒龟。分类 脊索动物门（Chordata）、爬行纲（Reptilia）、龟鳖目（Chelonia）、淡水龟科(Geoemydidae)、闭壳龟属(Cuora)。5 主要形态构造特征 外部形态特征 5.1.1 外形 体呈椭圆形，前部略窄、后部略宽。头光滑无鳞，鼓膜圆而清晰，头部背面呈橄榄色，两眼后各DB34/T 42232022 2 具一条金黄色条纹，颈部呈浅橘红色。背甲高而隆起，背甲由同心轮纹组成，中心呈绛红色或棕红色，中央脊棱明显，呈金黄色，侧棱不明显。腹甲大而平坦，呈棕黑色，腹甲外缘与缘盾腹面呈黄色，腹甲与背甲间有甲桥连接，腹甲前后两部分向上闭合于背甲，头、尾及四肢可完全缩入壳内。四肢略扁平，上覆有覆瓦状排列的鳞片，呈灰褐色，前肢基部呈浅橘红色，具五趾，趾端具钝性甲，后肢基部呈淡黄色，具四趾，趾端具钝性甲，趾间具微蹼，两后肢之间及尾部的皮肤具疣状突起。成年雌龟尾短、基部细，成年雄龟尾长、基部粗。黄缘闭壳龟的外部形态见图 1，雌雄背、腹面观见图 2。图1 黄缘闭壳龟外形图 图2 黄缘闭壳龟龟背、腹面观（左雌、右雄）5.1.2 可数性状 5.1.2.1 背甲 颈盾：1 枚。椎盾：5 枚。肋盾：8 枚，左右各 4 枚。缘盾：22 枚，左右各 11 枚。臀盾：2 枚，左右各 1 枚。DB34/T 42232022 3 5.1.2.2 腹甲 喉盾：2 枚，左右各 1 枚。胸盾：2 枚，左右各 1 枚。肱盾：2 枚，左右各 1 枚。腹盾：2 枚，左右各 1 枚。股盾：2 枚，左右各 1 枚。肛盾：2 枚，左右各 1 枚。5.1.2.3 甲桥 下缘盾：6 枚，左右各 3 枚。腋盾：2 枚，左右各 1 枚。胯盾：2 枚，左右各 1 枚。5.1.3 可量性状 雌性体重 52.3 g297.5 g，背甲长 50.3 mm108.6 mm，年龄 3+6+；雄性体重 64.8 g303.2 g，背甲长 104.6 mm121.2 mm，年龄 4+6+。各可量性状的比例见表1。表1 黄缘闭壳龟背甲长及与可量性状比例值 比例 雌龟 雄龟 平均值标准差 范围 平均值标准差 范围 背甲宽/背甲长 0.78 0.05 0.900.67 0.74 0.02 0.760.71 壳高/背甲长 0.45 0.03 0.530.38 0.48 0.04 0.560.44 腹甲宽/背甲长 0.60 0.03 0.660.52 0.60 0.01 0.620.58 腹甲后半部长/背甲长 0.34 0.04 0.600.23 0.33 0.02 0.340.30 腹甲前半部长/背甲长 0.54 0.06 0.630.06 0.53 0.02 0.560.52 腹甲后半部前宽/背甲长 0.57 0.03 0.640.48 0.58 0.01 0.600.56 腹甲后半部后宽/背甲长 0.34 0.04 0.430.23 0.36 0.02 0.380.33 甲桥长/背甲长 0.32 0.03 0.440.24 0.33 0.02 0.350.28 喉盾宽/背甲长 0.14 0.05 0.230.07 0.14 0.05 0.200.08 喉盾缝长/背甲长 0.15 0.02 0.190.07 0.16 0.01 0.180.15 肱盾缝长/背甲长 0.07 0.01 0.120.05 0.07 0.02 0.090.05 胸盾缝长/背甲长 0.19 0.02 0.240.13 0.20 0.02 0.220.17 腹盾缝长/背甲长 0.23 0.02 0.270.15 0.24 0.01 0.250.23 股盾缝长/背甲长 0.07 0.02 0.160.04 0.07 0.02 0.090.05 肛盾缝长/背甲长 0.26 0.05 0.590.17 0.25 0.02 0.270.22 注：各可量性状说明参见 GB/T 34727 内部构造特征 心脏具有 2 心房 1 心室，心室内具半隔膜。肺海绵状，左右 2 叶，紧靠前部椎板内侧。肝脏 3叶，左右两叶较大，中间叶较小。后肾 1 对，位于后部肋板内侧，各由 1 根输尿管通向膀胱。食道较长，胃分化明显，十二指肠上附有条形白色胰脏，无盲肠。雌雄异体，雄性睾丸 1 对，淡白色，卵圆形，位于肾脏前端内侧，后端为输精管，通泄殖腔，阴茎位于尾基部的泄殖孔内；雌体卵巢 1 对，位DB34/T 42232022 4 于肾脏前端内侧，紧靠椎板，呈黄色片状，内有粒状卵子，产卵期具多个成熟卵泡。6 生长和繁殖特性 生长 不同年龄组的黄缘闭壳龟体长与体重的实测值变动范围见表2。表2 黄缘闭壳龟不同年龄组实测背甲长、背甲宽与体重 年龄，年 0+1+2+3+4+5+6+背甲长（mm）45.52.85 60.775.32 106.639.13 116.884.53 132.126.42 139.837.25 151.524.89 背甲宽（mm）37.411.4 49.082.62 79.607.130 84.183.81 93.485.06 101.967.02 107.644.73 体重（g）17.112.0 39.638.46 241.0135.16 298.0939.44 433.1357.0 533.99128.09 650.4678.41 注：生长方程和背甲长与体重关系式参加附录A 繁殖 6.2.1 性成熟年龄 自然条件下，雌龟为 6+性成熟，雄龟是 5+性成熟。6.2.2 繁殖期 每年 5 月8 月产卵，5 月中旬 6 月上旬为产卵高峰期。6.2.3 产卵类型 一年多次产卵，一般每年产卵 1 次4 次。6.2.4 产卵量 每只雌龟每年产卵 1 枚/次4 枚/次。7 遗传学特性 细胞遗传学特性 7.1.1 体细胞染色体数：2 n=52；染色体臂数（NF）：70；核型公式：14m+4sm+24t+10mc。7.1.2 染色体核型见图 3，染色体组型见图 4。DB34/T 42232022 5 图3 黄缘闭壳龟染色体核型图 图4 黄缘闭壳龟染色体组型图 分子遗传学特征 黄缘闭壳龟线粒体 16SrRNA基因片段的碱基序列为 1596bp，种内K2P遗传距离为 0.0024，小于 2，标准序列见附录C。8 检测方法 抽样 按 GB/T 18654.2 的规定执行。性状测定 按 GB/T 34727 的规定执行。年龄鉴定 按 GB/T 34727 的规定执行。细胞遗传学检测 DB34/T 42232022 6 以 10 ug/g 体重剂量给龟腹腔注射植物血球凝集素（PHA），处理 24 h，以 6 ug/g 体重剂量腹腔注射秋水仙素，3.5 h 后取脾脏。0.0375 mol/L KCl低渗20 min。其他步骤按 GB/T 18654.12的规定执行。分子遗传学检测 检测方法应符合附录B的规定。9 判定规则 当检验结果符合第 5 章和第 7 章的要求，可以判定物种时，按第 5 章和第 7 章的要求判定。当出现下列情况之一时，增加检测第 6 章和第 8 章的要求内容，依据检测结果对物种进行辅助判定：a)第 5 章和第 7 章的项目无法进行检测或准确判定时；b)第三方提出要求时。DB34/T 42232022 7 附录A （资料性）黄缘闭壳龟生长方程和背甲长与体重关系式 A.1 体重、背甲长和背甲宽生长方程见公式（A.1）（A.3）。Wt1=12.73e 0.476（r=0.9843）(A.1)式中：Wt1 t 齢时龟体重，单位为克（g）；T 龟的年龄，齢。Lt=45.47 T0.466（r=0.9944）(A.2)式中：Ltt 齢时龟背甲长，单位为毫米（mm）；T龟的年龄，齢。Wt2=34.81 T0.461（r=0.9939）(A.3)式中：Wt2 t 齢时龟背甲宽，单位为毫米（mm）；T 龟的年龄，齢。A.2 体重、背甲长与背甲宽关系式见公式（A.4）（A.5）。Wt1=Lt3.018（r=0.9899）(A.4)式中：Wt1 t 齢时龟体重，单位为克（g）；Lt t 齢时龟背甲长，单位为毫米（mm）；T 龟的年龄，齢。Lt=0.82Wt21.191（r=0.9925）(A.5)式中：Lt t 齢时龟背甲长，单位为毫米（mm）；Wt2 t 齢时龟背甲宽，单位为毫米（mm）；T 龟的年龄，齢。DB34/T 42232022 8 附录B （规范性）黄缘闭壳龟线粒体 16SrRNA 基因分析方法 B.1 总 DNA 提取 取黄缘闭壳龟肌肉组织，剪碎，10蛋白酶K消化，DNA提取试剂盒提取总DNA。B.2 引物序列和 PCR 扩增条件 B.2.1 扩增引物序列为 16S F:5-CACAATAAACAAACAGATGAGGCAAGT-3；B.2.2 16S R:5-GAAAGCTACGGCGACGAGGA-3。PCR扩增条件为：94，5 min；94，30 s，62，90s，共30次循环；72，30 s，72，10 min。其它步骤按 GB/T 18654.15 的规定执行。B.3 PCR 产物纯化和回收 取 5 L 扩增产物上样到 1.0的琼脂糖凝胶进行电泳分离（见图B.1），然后割胶，用凝胶抽提试剂盒进行PCR产物纯化、回收。纯化产物用于测序分析，进行正反双向测序。图B.1 黄缘闭壳龟线粒体 16SrRNA 基因电泳图 B.4 遗传距离分析 利用Kimura两参数模型（Kimura 2 parameter，K2P）计算样品间两两遗传距离。DB34/T 42232022 9 附录C （资料性）黄缘闭壳龟线粒体 16SrRNA 基因标准序列 黄缘闭壳龟线粒体16SrRNA基因标准序列（1596bp）如下：1 GCAAGAACCT AGCCCAACCA AAATAAAAAA CTTAACAAAC AAAACTATCC 51 CACCAAAACC AACCAAAA