DB32T 2570-2013 鸡传染性法氏囊RT-LAMP诊断技术规程.pdf

ICS65.020.99 B22 备案号：40456-2014 江苏省地方标准 DB32DB32/T 2570-2013 鸡传染性法氏囊 RT-LAMP 诊断技术规程 Technical code of detecting RT-LAMP for Infectious Bursal Disease 2013-12-20 发布 2014-01-20 实施江苏省质量技术监督局 发 布 DB32/T 2570-2013 前 言 为规范鸡传染性法氏囊RT-LAMP诊断技术规程，提高鸡传染性法氏囊病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写要求编写。本标准的附录为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：刘宇卓、李银、黄欣梅、赵冬敏、韩凯凯、张敬峰。DB32/T 2570-2013 1 鸡传染性法氏囊 RT-LAMP 诊断技术规程 1 范围 本标准规范了鸡传染性法氏囊RT-LAMP诊断技术规程所用引物、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。本标准适用于鸡传染性法氏囊病毒病的实验室诊断、临床诊断、流行病学调查、分离毒株的鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 16548-2006 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 NY/T 541-2002 动物疫病实验室检验采样方法 DB13/T 500 商品肉鸡传染性法氏囊病防治技术规程 3 主要试剂和仪器 3.1 DNA Marker DL-2000 3.2 6xLoading buffer 3.3 Bst DNA Polymerase 3.4 MgSO4 3.5 DEPC 3.6 Betaine 3.7 lO XThermoPol buffer 3.8 异丙醇 3.9 无水乙醇 3.10 琼脂糖 3.11 核酸染料 3.12 氯仿 3.13 电泳仪 3.14 电热恒温水槽 4 引物 按照GenBank上公布的鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）A节段的基因序列(GenBankAY444873)，在VP3基因保守区域利用LAMP primer designing software PrimerExplorer设计一套引物，序列为：F3：5一 CCAACTGGGCGACGTTTA 一 3 B3：5一 CAGAATGGAACAGTGGGTCC 一 3 FIP：5一 GTCCTGCATTGGGTGGAAGGTATTTTTTTTCCTCACAATCCACGCG 一 3 BIP：5一 CTGGCTATGGCCGCTTCAGATTTTTGCTGCTTCCATGGCTCT 一 3 5 临床诊断 DB32/T 2570-2013 2 按照DB13/T 500 商品肉鸡传染性法氏囊病防治技术规程中4.1流行特点、4.2临床症状、4.3.1剖检病变进行。6 采样和样品的处理 6.1 病料的采集及处理 按照NY/T 541-2002动物疫病实验室检验采样方法，病死或扑杀鸡，无菌采集法氏囊及肾脏、肝脏组织，于04 冷藏保存并立即送检，采样过程中样品不得交叉污染。6.2 样品的处理 剖检取法氏囊及肾脏、肝脏组织，可单独使用，也可混合后使用。取上述病料或经鸡胚接种后的绒毛尿囊膜及胚体，置无菌研钵中剪碎并研磨，-20 反复冻融三次，将研磨好的组织以4 12000 rpm 离心10 min，取上清备用。7 RT-LAMP 7.1 RNA 的提取 取已处理的待检样品，以已知IBDV病毒为阳性对照，以无菌水为阴性对照，每管依次加入Trizol?600 L，振荡混匀后，室温放置10 min，加入氯仿200 L，剧烈振荡后，室温放置1 min，4 12000 rpm，离心15 min，取上层水相750 L，加入500 L异丙醇，混匀，-20 放置15 min，4 10000 rpm离心10 min，去上清，缓缓加入75%乙醇1 mL洗涤，4 8000 rpm离心5 min，去上清，室温干燥20 min，加入DEPC水10 L，使充分溶解。或使用RNA提取试剂盒进行提取。7.2 反应条件 FIP引物1.2 L，BIP引物1.2 L、F3引物0.15 L、B3引物0.15 L、Bst DNA poLymerase2 L、lO XThermoPol buffer2.5 L、100 mmol/L MgSO41.5 L、8 mmol/L Betaine5 L、10 mmol/L dNTPs 4 L、RNA酶抑制剂0.5 L、RNA模板2 L、反转录酶1.0 L、ddH2O 4.8 L，总体积为25 L，瞬间离心混匀。60 水浴60 min，80 灭活10 min，4 保存。7.3 RT-LAMP 结果观察及判定 下述两种方法任择其一：7.3.1 电泳 7.3.1.1 以阳性IBDV液作为阳性对照，以灭菌水作阴性对照，做RT-LAMP,所有反应产物同时电泳。取RT-LAMP反应产物各810 L于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120 V，时间3040 min，紫外灯下观察结果。7.3.1.2 在阳性对照有梯状目的条带，阴性对照无条带的情况下，检测样品出现与阳性对照相同梯状条带的判为阳性，即该样品的IBDV核酸呈阳性；检测样品未出现与阳性对照相同目的条带的判为阴性，即该样品为IBDV核酸阴性。如果阳性对照无相应的目的条带，或者阴性对照出现条带，结果均无效，该试验需要重做。7.3.2 显色反应 7.3.2.1 在每个RT-LAMP反应管内加入荧光染料0.5 L，旋涡混匀，肉眼观察颜色变化。7.3.2.2 加入核酸染料后510 min进行显色判定。肉眼观察反应管，当阳性对照管液呈现绿色，阴性对照管液呈现橘黄色时，说明染料正常，显色反应成立，可以进行其它样品的判定，否则，显色反应无效。其它样品，如反应管中液体呈绿色时，该样品即可判定为IBDV核酸阳性，呈橘黄色时判定为IBDV核酸阴性。DB32/T 2570-2013 3 8 结果判定 8.1 临床诊断的判定 当临床上出现与第 5 条流行病学、临床症状及剖检变化相符的情况，可以初步判定为鸡传染性法氏囊病。8.2 实验室 RT-LAMP 结果的判定 同7.3。8.3 诊断结果判定 如根据流行病学、临床症状及剖检变化可以初步临床诊断为鸡传染性法氏囊病，结合实验室RT-LAMP 检测结果，当鸡传染性法氏囊病病毒检测为核酸阳性时，即可将该病例诊断为鸡传染性法氏囊病。DB32/T 2570-2013 1 附录 A(规范性附录)阳性样品的制备 A.1 毒株 本研究室分离、鉴定并保存的鸡传染性法氏囊病毒毒株。A.2 制备 取保存毒株，用灭菌生理盐水作 1:50100 倍稀释，接种 9 日龄10 日龄 SPF 鸡胚尿囊膜，0.2 mL/枚。置 37 恒温箱继续培养，每天照蛋观察 3 次。弃去 48 h 前死亡胚，无菌收获 48 h120 h 死亡胚及尿囊膜，无菌剪碎并研磨，反复冻融三次后，12000 g 离心 10 分钟，吸取上清分装到 1.5 ml 离心管中，每管 200 L，-20 保存，备用。