DB37T 2841-2016 鸭坦布苏病毒半套式RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 28412016 鸭坦布苏病毒半套式 RT-PCR 检测方法 Detection method on duck Tembusu virus by semi-nested RT-PCR 2016-09-18 发布 2016-10-18 实施山东省质量技术监督局 发 布 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 28412016 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、唐熠、陈浩、冯强、提金凤。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 28412016 1 鸭坦布苏病毒半套式 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了鸭坦布苏病毒半套式RT-PCR（反转录-聚合酶链式反应）检测方法的样品采集和保存、样品处理、试剂及仪器、检测步骤、结果判定等。本标准所规定的鸭坦布苏病毒半套式RT-PCR检测方法适用于检测鸭组织、分泌物、排泄物和禽胚尿囊液中坦布苏病毒的核酸，也适用于鹅和其他动物坦布苏病毒核酸的检测。2 实验室条件 2.1 仪器 生物安全柜、PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像仪、微量移液器等。2.2 操作区域 样品操作区要有相应的生物安全设施；样品操作区、RNA提取区、PCR扩增区、电泳区应单一方向，不得倒流；电泳区与其他操作区域相互隔离。2.3 操作者 操作者应接受过实验室生物安全培训、分子生物学实验室检测技术培训。熟悉防止RNA降解、核酸污染和溴化乙锭污染的具体措施；熟悉RT-PCR检测结果的判断方法。3 试剂的准备 3.1 试剂 3.1.1 商品化的 RNA 提取试剂盒。3.1.2 rTaq DNA 聚合酶(5 U/L)；3.1.3 10PCR Buffer；3.1.4 M-MLV 反转录酶(200 U/L)；3.1.5 5M-MLV Buffer；3.1.6 dNTPs（2.5 mmol/L，10 mmol/L）；3.1.7 RNA 酶抑制剂；3.1.8 1.5%琼脂糖凝胶，见 A.1；3.1.9 1TAE 缓冲液，见 A.2；3.1.10 溴化乙锭（10g/L），见 A.3；3.1.11 核酸电泳加样缓冲液，见 A.4；3.1.12 商品化的 DNA 分子量标准，要求在 100 bp2000 bp 之间，有 5 条以上的指示条带；山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 28412016 2 3.1.13 已知的坦布苏病毒鸭胚尿囊液制作的阳性对照标准品；3.1.14 用高压灭菌的蒸馏水作为阴性对照标准品。3.2 引物 反转录所需随机引物 Random Primer(9 mer)，引物浓度为100 mol/L。检测所需引物 上游引物5455F：5-ATGGATGAAGCYCATTTCAC-3；下游内侧引物5371R：5-CCAAAGTTGGCYCCCATCTC-3；下游外侧引物5861R：5-AGCACACGGCAATCTCAT-3，扩增片段长度为277bp。引物浓度为100 mol/L。4 操作程序 4.1 样品的采集和处理 4.1.1 样品的采集 死亡鸭采集卵泡膜、脾和脑等组织样品，进行分别处理或同时处理；活鸭采集咽喉或泄殖腔拭子。4.1.2 样品的保存 样品应放在含有抗生素的pH值7.07.4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS，附录B.1）内（无PBS可用25%50%甘油盐水，见附录B.2）。抗生素的选择视当地情况而定，组织和咽喉拭子悬液中应含有青霉素(2000 IU/mL),链霉素(2 mg/mL)、庆大霉素(50 g/mL)和制霉菌素(1000 IU/mL)，加入抗生素后pH值应调至7.07.4。在室温放置1 h2 h内样品应尽快处理，不能处理的可在4 存放24 h，也可于低温条件下保存(-70 贮存最好)。4.1.3 病料的处理 样品处理在生物安全柜中进行，咽喉或泄殖腔拭子，置于200 L含有抗生素的pH值7.07.4等渗磷酸盐缓冲液中；研碎的组织用含抗生素pH值7.07.4的等渗PBS溶液配成10%20%(g/mL)的悬液。样品液经8000 r/min离心10 min，取上清液作为检测材料。4.2 对照设置 每次检测，用相应的阳性对照标准品和阴性对照标准品，至少设置一个或一个以上的阴性对照和阳性对照。4.3 RNA 提取 按照RNA提取试剂盒说明书，提取样品和对照的RNA。提取的RNA应随时检测，否则应于-70 冻存。4.4 反转录反应体系 RNA 5 L，5M-MLV Buffer 2 L，随机引物1 L，dNTPs(10 mmol/L)0.5 L，RNA酶抑制剂0.5 L，M-MLV反转录酶1 L，共10 L。4.5 反转录条件 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 28412016 3 30 10 min，42 60 min，70 10 min，4 结束。4.6 PCR 反应 4.6.1 第一次 PCR 反应 4.6.1.1 PCR 的反应体系 10PCR Buffer 2.5 L，dNTPs（2.5 mmol/L）2 L，引物5455F（100 mol/L）和5861R（100 mol/L）各0.5 L，反转录产物3 L，rTaq DNA聚合酶0.25 L，加ddH2O至25 L。4.6.1.2 PCR 反应条件 94 预变性5 min；94 30 s，50 30 s，72 30 s，进行30个循环；72 延伸5 min。4.6.2 套式 PCR 反应 4.6.2.1 套式 PCR 反应体系 10PCR buffer 2.5 L，dNTPs（2.5 mmol/L）2 L，引物5455F（100 mol/L）和5731R（100 mol/L）各0.5 L，第一次PCR产物1 L，rTaq DNA聚合酶0.25 L，加ddH2O至25 L。4.6.2.2 PCR 反应条件 94 预变性5 min，94 30 s，50 30 s，72 30 s，进行30个循环；72 延伸5 min。4.7 套式 PCR 产物电泳 套式PCR反应结束后，取9 L样品与1 L核酸电泳加样缓冲液混匀后，于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，在位于凝胶中央的孔加入DNA分子量标准。加样后，按照5 V/cm电压，电泳20 min40 min（每次电泳时，每隔10 min观察一次。当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下2/5处时，可停止电泳）。电泳后，置于凝胶成像仪下观察，根据分子量标准判断套式PCR扩增产物大小。4.8 结果判定 阳性对照出现相应大小的扩增条带，且阴性对照无此扩增条带时，判定检测有效；否则判定检测结果无效，不能进行判断。坦布苏病毒半套式PCR产物的大小为277 bp。如果在阳性对照出现277 bp扩增条带，阴性对照无条带出现（引物二聚体除外）时试验成立。被检样品出现277 bp条带为坦布苏病毒阳性，否则为阴性（附录C）。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 28412016 4 A A 附 录 A（规范性附录）相关试剂的配制 A.1 1.5%琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖 1.5 g 0.5TAE 电泳缓冲液加至 100 mL 微波炉中完全融化，待冷至50 60 时加入溴化乙锭（EB）溶液5 L，摇匀。倒入电泳板上，凝固后，取下梳子，备用。A.2 1TAE 电泳缓冲液的配制 A.2.1 配制0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（pH8.0）乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na22H2O）18.61 g 灭菌双蒸水 80.0 mL 氢氧化钠调pH至 8.0 灭菌双蒸水加至 100 mL 用于配制A.2.2中的50TAE 电泳缓冲液 A.2.2 配制50TAE 电泳缓冲液 羟基甲基氨基甲烷（Tris）242 g 冰醋酸 57.1 mL 0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（pH8.0）100 mL 灭菌双蒸水加至 1000 mL 用于配制A.2.3中的1TAE A.2.3 配制1TAE 电泳缓冲液 50TAE 电泳缓冲液 20 mL 灭菌双蒸水加至 1000 mL A.3 溴化乙锭的配制 溴化乙锭 20 mg 灭菌双蒸水加至 20 mL A.4 核酸电泳加样缓冲液(10)聚蔗糖 25 g 灭菌双蒸水 100 mL 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 28412016 5 溴酚蓝 0.1 g 二甲苯青 0.1 g 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 28412016 6 B B 附录 B（规范性附录）试剂的配制 试剂的配制 B.1 PBS溶液的配制 NaCl 3.9 g Na2HPO412H2O 0.2 g KH2PO4 0.2 g 双蒸馏水加至 1000 mL B.2 50%甘油盐水 甘油 50 mL NaCl 0.9 g 蒸馏水加至 100 mL 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 28412016 7 C C 附录 C（规范性附录）半套式 RT-PCR 产物大小对照 M为分子量标准；N为阴性对照，1、2为阳性对照 图C.1 半套式 RT-PCR 产物大小对照图 _ 山东省地方标准公开山东省地方标准公开