DB37T 2794-2016 沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温扩增检测技术.pdf

ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 27942016 沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温 扩增检测技术 Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella typhimurium and Salmonella choleraesuis 2016-07-29 发布 2016-08-29 实施山东省质量技术监督局 发 布 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 27942016 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省农业科学院提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：黄保华、时建立、李俊、彭喆、刘畅、朱荣生、徐绍建、丛晓燕、杜以军、吴家强、孙文博。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 27942016 1 沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温扩增检测技术 1 范围 本标准规定了鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）的环介导等温扩增（LAMP）检测技术的要求。本标准适用于疑似污染鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌的各种样品检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 4789.4-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 3 材料 3.1 器材 3.1.1 微量移液器（最大量程分别为 10L、20L、100L、1000L）3.1.2 20000g 低温高速离心机 3.1.3 电热恒温水槽 3.1.4 稳流稳压电泳仪 3.1.5 水平电泳槽 3.1.6 凝胶成像系统 3.1.7 紫外透射反射分析仪 3.1.8 电磁炉 3.1.9 烧杯（1000mL）3.2 试剂 3.2.1 5mol/L Betaine 溶液：配制见附录 A.1 3.2.2 Bst DNA Polymerase（8U/L）3.2.3 SYBR Green 核酸染料 3.2.4 0.5TBE 缓冲液：配制见附录 A.2。3.2.5 1%琼脂糖电泳液：配制见附录 A.3。3.2.6 10 mg/mL 的溴化乙锭（EB）水溶液。3.2.7 DNA Marker 2000。3.2.8 超纯水：符合 GB/T 6682 要求。3.3 引物 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 27942016 2 鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测引物：F3：5-CGATAATTTCATCTTCAATTTCTGG-3 B3：5-CGTGAGATATCGTCCAAAAGG-3 FIP：5-GCACTCCGGTTGTAAACCATTATTT-GTACTGAGGCTAATTCACCAC-3 BIP：5-AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTT-GTTTGTTTTTGATGATACAGGC-3 猪霍乱沙门氏菌LAMP检测引物：F3：5-GGAGGAAGGTAGGGATGACG-3 B3：5-CACTCCCATGGTGTGACG-3 FIP：5-TCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTT-CCCTTACGACCAGGGCTA-3 BIP：5-CGGATTGGAGTCTGCAACTCGA-GGAACGTATTCACCGTGGC-3 4 方法 4.1 样品处理及 DNA 的提取 样品前处理及增菌按照GB 4789.4-2010中5.1、5.2操作。取1 mL增菌液放入1.5毫升EP管中，10 000 r/min离心2 min，去上清；加入灭菌生理盐水1 mL混匀，10000 r/min离心2 min，去上清；然后加灭菌双蒸水1 mL混匀，放入沸水浴中煮沸10min，取出后迅速放入冰块中，冷却5min,12000rpm，离心3min,吸上清液作为DNA模板，并保存于-20备用。4.2 环介导等温扩增（LAMP）操作流程 4.2.1 环介导等温扩增反应体系配制 按表1中1-8的循序配制。表1 环介导等温扩增反应体系 1 10ThermoPol 2.5 L 2 dNTP 混合液(10mmol/L)4.0L 3 B3/F3(5mol/L)0.15 L2 4 BIP/FIP(50mol/L)1.5 L2 5 Betaine(5mol/L)3.0 L 6 DNA 1.0 L 7 Bst DNA Polymerase(8U/L)1 L 8 超纯水 10.2 L 4.2.2 LAMP 程序设定 每次 LAMP 均应设一个阴性对照（用超纯水作为模板），具体参数见表 2。表2 LAMP 反应程序设定 温度 时间 1 63 鼠伤寒沙门氏菌60min 猪霍乱沙门氏菌75min 2 80 5min 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 27942016 3 4.3 电泳操作 4.3.1 1%琼脂糖凝胶板的制备 称取0.6g琼脂糖，加入60mL 0.5TBE缓冲液中，加热融化，温度降低后加入1%的EB，倒入电泳槽中，见附录A.3。4.3.2 加样 将LAMP扩增产物5L与1L 6Loading Buffer混合，点样于1%琼脂糖凝胶孔中，以DNA Marker作相对分子质量指示。每次电泳至少加1孔阳性对照的扩增产物作对照。4.3.3 电泳 保持稳定电压80V，电泳20min，观察结果。5 结果分析和判定 5.1 结果观察判定 电泳反应结束后，在阴性对照成立的情况下，出现瀑布样条带的泳道判为样品阳性（说明样品中含有鼠伤寒沙门氏菌或者猪霍乱沙门氏菌），不出现瀑布样条带的为阴性。5.2 可视化结果 加入1L SYBR Green 核酸染料，混匀（加深观察颜色），阳性反应管内液体变为黄色，阴性反应管不发生颜色变化，为橘红色。反应管置于紫外透射反射分析仪下，阳性反应管发出明亮的黄绿色荧光，阴性反应管不显现荧光。5.3 特异性和灵敏度 特异性：扩增绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、副鸡嗜血杆菌、巴氏杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌等细菌的DNA均为阴性。灵敏度：鼠伤寒沙门氏菌DNA倍比稀释到106倍仍可检出，猪霍乱沙门氏菌DNA倍比稀释到108倍仍可检出。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 27942016 4 A A 附 录 A（规范性附录）试剂的配制 A.1 5mol/L Betaine溶液 Betaine 1.4644g 灭菌超纯水 2.5mL A.2 0.5TBE缓冲液 Tris 108g Na2EDTA.2H2O 7.44g 硼酸 55g 灭菌超纯水 1L，配成10TBE缓冲液 取10TBE缓冲液25mL，加灭菌超纯水475mL，制成0.5倍的工作液。A.3 1%琼脂糖电泳板 琼脂糖 0.6g 0.5TBE缓冲液 60mL _ 山东省地方标准公开山东省地方标准公开