DB34T 4205-2022 禽蛋中9种禁用药物的残留量检测 高效液相色谱-串联质谱法.pdf

ICS 67.120.20 CCS X 18 34 安徽省地方标准 DB34/T 42052022 禽蛋中 9 种禁用药物的残留量检测 高效液相色谱-串联质谱法 Determination of 9 banned drugs residues in poultry eggs by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method 2022-06-29 发布 2022-07-29 实施 安徽省市场监督管理局 发 布 DB34/T 42052022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽省兽药饲料监察所提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：安徽省兽药饲料监察所、安徽华测检测技术有限公司、安徽省公众检验研究院有限公司、望江县畜牧兽医技术推广中心、安徽省畜牧兽医技术推广总站、安徽农业大学、安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、宣城市宣州区市场监督管理局、安徽银源禽业发展有限公司、望江县农产品质量安全中心。本文件主要起草人：汤春莲、李珲、李伟、李平松、蔡一杰、张莉、王雨霜、陈文帮、王希春、吴昊、许世富、詹凯、吴敏、李佳庆、操军、吴蕾、刘红云、宋亚伟、刘舜舜、冯成、郝金华、宋祥军、赵瑞宏、刘发全。DB34/T 42052022 1 禽蛋中 9 种禁用药物的残留量检测 高效液相色谱-串联质谱法 1 范围 本文件规定了禽蛋中甲硝唑、金刚烷胺、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、恩诺沙星、强力霉素、氟苯尼考、氯霉素残留量的高效液相色谱-串联质谱法检测方法。本文件适用于禽蛋中甲硝唑、金刚烷胺、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、恩诺沙星、强力霉素、氟苯尼考、氯霉素残留量的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理 试样经 80%乙腈水溶液提取，固相萃取净化、洗脱，高效液相色谱-串联质谱法进行分析，外标法定量。5 试剂和材料 试剂除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的一级水的要求。甲醇，色谱纯。乙腈，色谱纯。乙酸铵，色谱纯。溶液配制如下：10%甲醇溶液：取甲醇 100 mL，加水定容至 1000 mL，混匀；80%乙腈溶液：取乙腈 800 mL，加水定容至 1000 mL，混匀；流动相由 A、B 两种溶液按比例随时间梯度混合而成：A：5 mmol/L乙酸铵溶液（称取 0.385 g乙酸铵，用水溶解后定容至 1000 mL混匀，过滤）；B：乙腈。标准物质如下：甲硝唑标准品（CAS 号：443-48-1），纯度 99.9%；金刚烷胺标准品（CAS 号：768-94-5），纯度 97.5%；DB34/T 42052022 2 诺氟沙星标准品（CAS 号：70458-96-7），纯度 97.2%；氧氟沙星标准品（CAS 号：82419-36-1），纯度 95.7%；培氟沙星标准品（CAS 号：70458-96-6），纯度 92.1%；恩诺沙星标准品（CAS 号：93106-60-6），纯度 99.9%；强力霉素标准品（CAS 号：24390-14-5），纯度 98.7%；氟苯尼考标准品（CAS 号：73231-34-2），纯度 99.9%；氯霉素标准品（CAS 号：56-75-7），纯度 99.2%。标准储备液：准确称取 25 mg 甲硝唑、金刚烷胺、强力霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、氯霉素标准品，分别置于 25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分摇匀，制得 1 mg/mL 的标准储备溶液，密封，-18保存，有效期 6 个月。混合标准液（10 g/mL）：精确量取 9 种标准储备液，各 0.1 mL 于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，制得 10 g/mL 的混合标准溶液，密封，-18保存，有效期 3 个月。混合标准工作液：取混合标准储备液（10 g/mL）适量，用 10%的甲醇水溶液稀释，得到浓度为 1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 的系列混合标准工作液，4保存，有效期 1 周。6 仪器和设备 如下：高效液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源）；高速冷冻离心机：16000 r/min；氮吹仪；涡旋混合仪；PRiME HLB 固相萃取柱：60 mg，3 mL，或相当者；分析天平：感量 0.1 g、0.1 mg、0.01 mg；微孔滤膜：0.22 m 无机滤膜。7 试样的制备 将禽蛋去壳后混合均匀，-18 保存备用，3 个月内进行分析测试。8 测定步骤 提取 称取试料 2 g（精确至 0.1 g）置于 50 mL离心管内，加入 80%乙腈水溶液 8.0 mL，涡旋 1 min，高速振荡提取 5 min，10000 r/min离心 10 min，取上清液用于固相萃取柱净化。取 4.0 mL上清液到PRiME HLB固相萃取柱中，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液。于 45 水浴中用氮气吹干，用 10%甲醇水溶液 1.0 mL溶解，涡旋混匀，经 0.22 m微孔滤膜过滤后供高效液相色谱-串联质谱仪测定。色谱条件 如下：DB34/T 42052022 3 色谱柱：C18色谱柱（2.1 mm 50 mm，1.8 m），或相当者；流动相：A（5 mmol/L 乙酸铵溶液）、B（乙腈），采用梯度洗脱见表 1；流速：0.3 mL/min；进样量：5 L；柱温：30。表表1 1 梯度梯度洗脱程序洗脱程序 时间（min）流动相 A（%）流动相 B（%）0 90 10 2 90 10 8 30 70 8.01 90 10 10 90 10 质谱系统条件 如下：离子源：电喷雾离子源（ESI）；电喷雾电压（IS）：5500 V；扫描模式：ESI+和 ESI-同时扫描；检测模式：多反应监测（MRM）；雾化气温度（Gas Temp）：300；雾化气流量（Gas Flow）：17 L/min；鞘气温度（Shealth Gas Temp）：300；鞘气气流量（Shealth Gas Flow）：11 L/min；定性离子对、定量离子对、裂解电压（Fragmentor potential）和碰撞气能量（CE）见表2。表表2 2 定性、定量离子对及其他参数条件定性、定量离子对及其他参数条件 药物名称 定性、定量离子对（m/z）扫描模式 裂解电压（E/V）碰撞能量（E/V）甲硝唑 172.2/127.9*ESI+380 20 172.2/82 37 金刚烷胺 152.1/135*ESI+380 25 152.1/93 38 诺氟沙星 320.1/276.1*ESI+380 26 320.1/233.1 35 氧氟沙星 362.2/318.1*ESI+380 26 362.2/261.1 38 培氟沙星 334.1/316.1*ESI+380 27 334.1/290.2 25 恩诺沙星 360.1/316.1*ESI+380 25 360.1/245.1 35 DB34/T 42052022 4 定性测定 8.4.1 保留时间 待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在 2.5%之内。8.4.2 定量离子、定性离子及离子丰度比 每种化合物的质谱定性必须出现，至少应包含一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表 3 规定的范围。表表3 3 定性时相当离子丰度的最大允许偏差定性时相当离子丰度的最大允许偏差 相当离子丰度 50%20%50%10%20%10%允许的相对偏差 20%25%30%50%定量测定 取试料溶液和空白添加溶液，做单点或多点校准，外标法计算，即得。9 种药物标准溶液的MRM色谱图见附录A。结果的计算与表述 8.6.1 结果计算 试样中 9 种药物的含量利用数据处理系统计算或按式（1）计算：=13100021000(1)式中：Xi试样中药物含量，单位为微克每千克（g/kg）；Ci试样色谱峰对应的药物浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；M试样质量，单位为克（g）；V1提取液体积，单位为毫升（mL）。V2过柱上清液体积，单位为毫升（mL）；V3溶解液体积，单位为毫升（mL）。8.6.2 结果表示 强力霉素 445.1/428.1*ESI+380 24 445.1/154.1 35 氟苯尼考 356.1/119*ESI-380 23 356.1/184.9 12 氯霉素 321/152.1*ESI-380 24 321/256.9 17 注：*为定量离子对。DB34/T 42052022 5 测定结果保留至小数点后 1 位有效数字。9 灵敏度、准确度和精密度 灵敏度 本方法 9 种药物的检测限均为 0.1 g/kg，9种药物的定量限均为 0.2 g/kg。准确度 本方法在禽蛋中 2.0 g/kg添加浓度水平上，9 种药物的回收率结果见表 4。表表4 4 9 9 种药物的种药物的回收率回收率结果结果 化合物 加标水平/（g/kg）回收率范围/%甲硝唑 2 88.9%95.6%金刚烷胺 2 88.6%93.5%诺氟沙星 2 85.6%91.8%氧氟沙星 2 81.5%86.7%培氟沙星 2 80.3%83.8%恩诺沙星 2 81.9%85.1%强力霉素 2 77.2%81.6%氟苯尼考 2 89.6%94.6%氯霉素 2 79.5%82.4%精密度 本方法的批内、批间相对标准偏差均 10%。DB34/T 42052022 6 附录A （资料性）9 种药物标准溶液的 MRM 色谱图 9 种药物标准溶液的MRM色谱图见图A.1图A.18。图A.1 甲硝唑定性离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 图A.2 甲硝唑定量离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 图A.3 强力霉素定性离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 DB34/T 42052022 7 图A.4 强力霉素定量离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 图A.5 氧氟沙星定性离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 图A.6 氧氟沙星定量离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 DB34/T 42052022 8 图A.7 恩诺沙星定性离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 图A.8 恩诺沙星定量离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 图A.9 培氟沙星定性离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 DB34/T 42052022 9 图A.10 培氟沙星定量离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 图A.11 诺氟沙星定性离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 图A.12 诺氟沙星定量离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 DB34/T 42052022 10 图A.13 金刚烷胺定性离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 图A.14 金刚烷胺定性离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 图A.15 氟苯尼考定性离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 DB34/T 42052022 11 图A.16 氟苯尼考定量离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 图A.17 氯霉素定性离子对标准溶液（20 ng/mL）的 MRM 色谱图 图A.18 氯霉素定量离子