DB34T 3861-2021 畜禽血清中黄曲霉毒素B1生物标志物的测定 高效液相色谱法.pdf

ICS 01.CCS A 0安畜禽2021-0120 00 徽禽血清Determin01-25 发布 徽清中黄定nation of A布 安省黄曲霉定 高AFB1 biomchrom安徽省市场地 霉毒素高效液marker in matograph 场监督管理方素 B1 生液相色serum hhic method 理局 发方DB生物标谱法 high perfod 发 布34标B34/T 386标志物ormance li2021-4 准612021 物的测quid-02-25 实准 测实施DB34/T 38612021 I 前言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽农业大学提出。本文件由安徽省农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司（农业农村部猪肉质量安全控制重点实验室）、望江县小月山农业发展有限公司、和县农业农村局、望江县畜牧兽医局、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、宿松县春润食品有限公司。本文件主要起草人：王希春、杨长根、陈祥国、赵家喜、沈艳、高亚飞、王军、汤继顺、赵杰、吴金节、李玉、冯士彬、孙裴、涂健、冯江华。DB34/T 38612021 1 畜禽血清中黄曲霉毒素 B1 生物标志物的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件确立了畜禽血清中黄曲霉毒素B1 生物标志物含量的高效液相色谱法测定方法，并规定了测定原理、试剂和设备、测定步骤、测定结果的表述、重复性、检出限与定量限、回收率。本文件适用于畜禽血清中 AFB1 生物标志物的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 黄曲霉毒素 B1 Aflatoxin B1，AFB1 主要由黄曲霉与寄生曲霉代谢产生的一种真菌毒素，进入体内以后会与血液白蛋白中的赖氨酸（Lysine）结合形成稳定的生物标志物 AFB1-Lysine。4 原理 通过蛋白酶的消化，从血清白蛋白中释放出 AFB1 生物标志物，采用固相萃取柱浓缩。浓缩的 AFB1生物标志物经高效液相色谱仪分离，用荧光检测器检测。5 试剂和设备 5.1 试剂与材料 5.1.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。5.1.2 蛋白酶。5.1.3 磷酸二氢铵（NH4H2PO4），分析纯。5.1.4 叠氮化钠（NaN3），分析纯。5.1.5 白蛋白试剂（DMA）：生物试剂。5.1.6 蛋白检测染料试剂浓缩液（考马斯亮蓝 G-250）5.1.7 氯化钠（NaCl），分析纯。5.1.8 磷酸氢二钠（Na2HPO4），分析纯。5.1.9 磷酸二氢钾（KH2PO4），分析纯。DB34/T 38612021 2 5.1.10 氢氧化铵（NH4OH），分析纯。5.1.11 甲酸（HCOOH），分析纯。5.1.12 AFB1生物标志物标准品 AFB1-Lysine（纯度99）。5.1.13 除另外说明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 的一级水。5.2 仪器与设备 5.2.1 高效液相色谱仪（含荧光检测器、柱温箱）。5.2.2 水浴恒温摇床。5.2.3 固相萃取柱（1 cc/30 mg）。5.2.4 粒径 5 m C18 高效液相色谱柱（250 4.6 mm）。5.2.5 涡旋振荡器。5.2.6 微量进样器。5.2.7 天平（感量 0.0001 g）。5.2.8 pH 计。5.2.9-80超低温冰箱。5.2.10 冷冻离心机：转速3500 g。5.2.11 紫外分光光度计。6 测定步骤 6.1 样品制备 无菌采集新鲜血液 5 mL，室温静置 2 h，2000 g 离心 15 min，取上清液转移至另一离心管中。6.2 总蛋白及白蛋白含量测定 6.2.1 血清总蛋白浓度测定 6.2.1.1 4下精密称取 1 mg/mL 蛋白标准品置于玻璃管中用于制备标准曲线，各管添加量见表 1。表1 血清总蛋白标准曲线绘制 序号 标准溶液(L)水(L)标准(g)1 0 800 0 2 2 798 2 3 4 796 4 4 6 794 6 5 8 792 8 6 10 790 10 7 15 785 15 6.2.1.2 取待测血清 5 L 至离心管中，加入 95 L 水稀释样品，涡旋混合均匀，然后将 4 L 稀释样品转移到预先添加 796 L 水的玻璃试管中；向所有管中加入 200 L 考马斯亮蓝 G-250，室温下涡旋，混合均匀转移至待测试管中；以试管 1 作为空白，在 595 nm 的波长下，使用紫外分光光度DB34/T 38612021 3 计进行测量；记录标准品和样品的吸光度读数，根据标准吸光度制作标准曲线，由公式计算可得总蛋白浓度。6.2.1.3 血清总蛋白含量计算公式见公式（1）、公式（2）、公式（3）：标准曲线：y?ax?b (1)X?a b)-(A (2)150 L 血清总蛋白浓度 C?1000 15025020X (3)式中：X 待测血清中总蛋白含量（g）；A 待测血清吸光度读数；a 标准曲线斜率；b 标准曲线截距。6.2.2 血清白蛋白含量测定 6.2.2.1 4下取 4 g/dL 蛋白标准品溶液置于玻璃管中用于制备标准曲线，各管添加量见表 2。表2 血清白蛋白标准曲线制备 序号 标准品溶液(L)水(L)标准品(g)1 0 20 0 2 2.5 17.5 100 3 5 15 200 4 7.5 12.5 300 5 10 10 400 6 15 5 600 7 20 0 800 6.2.2.2 取待测血清10 L置于一个单独的玻璃试管，并在管内加10 L水；向所有管中加入1 mL DMA，室温下涡旋；混合均匀转移至待测试管中，以试管 1 作为空白，在 630 nm 的波长下，使用紫外分光光度计进行测量；记录标准品和待测血清的吸光度读数，根据标准吸光度制作标准曲线，由公式计算可得血清白蛋白含量。6.2.2.3 150 L 血清白蛋白计算公式见公式（4）、公式（5）、公式（6）：标准曲线：y?ax?b (4)X?a b)-(A (5)DB34/T 38612021 4 150 L 血清白蛋白浓度?10X?150 L (6)式中：X 10 L 待测血清中白蛋白含量（g）；A 待测血清吸光度读数；a 标准曲线斜率；b 标准曲线截距。6.3 蛋白质消化 在离心管中添加 150 L 血清和 10 mg/mL 蛋白酶（附录 A.1.7），血清与蛋白酶比例为 1:4，酶需要量为血清总蛋白含量 1041000C（mL），37水浴摇床中孵育 3 h，确保水位达到标准线，样品在摇床上消化 3 h。6.4 待测样本纯化 加入 1 mL 水、1 mL 甲醇激活平衡固相萃取柱，自然流出，依次加入待测血清，1.0 mL/min 的流速顺序分两次各加入 1 mL 水洗涤、1 mL甲醇-水溶液（附录 A.1.4）和氢氧化铵（附录 A.1.8）洗涤，在 0.5 mL 甲醇中洗脱后干燥，用 1 mL 甲酸-水溶液（附录 A.1.5）洗脱纯化两次，收集洗脱液，干燥 55 min。向所得干燥物中加入 150 L 甲醇-水溶液（附录 A.1.3），涡旋 5 min，3500 g 离心 5 min，在 2 min 内进样分析。6.5 仪器设定条件 6.5.1 色谱柱：C18 柱，250 mm4.6 mm，5 m 或相当者。6.5.2 检测波长：激发波长 405 nm，发射波长 470 nm。6.5.3 流动相：A 相:磷酸二氢铵（附录 A.1.1）（含叠氮化钠）；B 相:甲醇。梯度洗脱，洗脱程序见表 3。6.5.4 流速：1.0 mL/min。6.5.5 柱温：25。6.5.6 进样量：150 L。表3 流动相洗脱程序 时间 min 流动相 A 流动相 B 0 30 70 5 30 70 15 65 35 18 65 35 20 30 70 6.6 试样溶液的测定 6.6.1 在 6.5 色谱条件下，将 150.0 L AFB1 生物标志物标准工作溶液（附录 A.2.2）按浓度从低到DB34/T 38612021 5 高依次注入高效液相色谱仪，AFB1 生物标志物标准品色谱图参考附录 B；待仪器条件稳定后，以目标物质的浓度为横坐标（x 轴），目标物质的峰面积为纵坐标（y 轴），对各个数据点进行最小二乘线性拟合，标准曲线见公式（7）：y?ax?b (7)式中：y 目标物质的峰面积比；a 标准曲线的斜率；x 目标物质的浓度；b 标准曲线的截距。6.6.2 标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如果样本含量超过标准曲线范围，需稀释后再测定。6.7 空白试验 不加入标准品，按 6.3、6.4 的步骤做空白实验。确认不含有干扰待测组分的物质。7 测定结果的表述 样品分析见公式（8）：X?3i10mfVc (8)式中：X 待测血清白蛋白中 AFB1 生物标志物的含量，单位为皮克每毫克（pg/mg）；ci 待测物进样液中 AFB1 生物标志物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；f 试液稀释倍数；m 150.0 L 血清中白蛋白含量，单位为毫克（mg）。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位有效数字。8 重复性 血清样本中 AFB1 生物标志物含量在重复性条件下获得的绝对差值不得超过算术平均值的 15。9 检出限与定量限 本标准血清 AFB1 生物标志物的最低检出限为 0.02 ng/mL，定量限为 1.0 ng/mL。10 回收率 添加浓度在 0.5 ng/mL1.0 ng/mL 时，回收率在 7594之间。DB34/T 38612021 6 附录A （规范性）试剂与标准品溶液配制 A.1 溶液配制 A.1.1 磷酸二氢铵（20 mmol/L，pH 7.2）：称取 2.3 g 无水磷酸二氢铵，溶于 1000 mL 水中，用氨水调 pH 至 7.2，混合均匀。A.1.2 叠氮化钠（0.001）：称取叠氮化钠 1.0 mg，溶于 100 mL 水，混合均匀。A.1.3 甲醇-水溶液（25+75）：分别量取 250 mL 甲醇和 750 mL 水，混合均匀。A.1.4 甲醇-水溶液（70+30）：分别量取 700 mL 甲醇和 300 mL水，混合均匀。A.1.5 甲酸-水溶液（2+98）：分别量取 20 mL 甲酸和 980 mL 水，混合均匀。A.1.6 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取 8.0 g 氯化钠、1.2 g 磷酸氢二钠、0.2 g 磷酸二氢钾、0.2 g 氯化钾，用 980 mL 水溶解，然后用盐酸调整 pH 至 7.4，最后用水稀释至 1000 mL，混合均匀。A.1.7 蛋白酶（蛋白质：总蛋白：1:4，w/w）：称取链霉蛋白酶置于离心管中，将其重量（mg）除以10 后，加入等量的 PBS。不用时放入冰箱。A.1.8 氢氧化铵-水溶液（1+99）：分别量取 10 mL 氢氧化铵和 990 mL 水，混合均匀。A.2 AFB1生物标志物标准溶液配制 A.2.1 标准储备溶液（0.1 mg/mL）：精密称定 AFB1-Lysine 标准品（纯度99）0.01g（精确至 0.0001 g）至小烧杯中，用甲醇-水溶液（A.1.3）溶解，并转移至 100 mL 容量瓶中，定容至刻度。此溶液密封后-20避光保存。有效期 6 个月。A.2.2 标准工作液：将标准溶液用甲醇-水溶液（A.1.3）稀释，配制成 AFB1-Lysine 浓度依次为 0.02 ng/mL、0.05 ng/mL、0.10 ng/mL、0.20