DB32T 3979-2021 实验用斑马鱼饲育技术条件.pdf

ICS07.080CCS A4032江苏省地方标准DB 32/T 39792021实验用 斑马鱼 饲育技术条件Technical requirements for breeding laboratory zebrafish2021-02-03 发布2021-03-03 实施江苏省市场监督管理局发 布DB32/T 3979-2021I目次前言.III1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14饲育鱼房工艺布局.14.1饲育鱼房总体要求.14.2饲育鱼房功能分区.25饲育设施.25.1流水饲育系统.25.2静水饲育系统.36饲育环境条件.36.1温度.36.2湿度.36.3空气.36.4环境噪音.36.5光照.36.6饲育用水.46.7流水循环速度.46.8日换水量.47饲育密度与饵料及饲喂.47.1饲育密度.57.2饲育饵料.57.3饲喂.58繁育和遗传资源保存.58.1繁育安排.58.2新创制遗传资源保存.59伦理维护.69.1福利保障.69.2饲育人员技能.69.3生长记录.69.4标识.69.5安乐死.610质量规范.610.1实验用斑马鱼来源.610.2胚胎的质量.610.3仔鱼的质量.610.4幼鱼与成鱼的质量.6DBFORMTEXT32/TFORMTEXT3979FORMTEXT2021II附录 A（资料性）草履虫培育.8附录 B（资料性）丰年虫幼虫孵化及脱盐处理.9参考文献.10DB32/T 3979-2021III前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省实验动物标准化专业技术委员会提出并归口。本文件起草单位：南京尧顺禹生物科技有限公司。本文件主要起草人：赵庆顺、池军、王明开、张琼。DB32/T 3979-20211实验用 斑马鱼 饲育技术条件1范围本文件规定了实验用 斑马鱼 饲育技术条件的饲育鱼房工艺布局、饲育设施、饲育环境条件、饲育密度与饵料及饲喂、繁育和遗传资源保存、伦理维护以及质量规范。本文件适用于实验用斑马鱼的饲育。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 5749 生活饮用水卫生标准GB/T 18883 室内空气质量标准GB/T 31962 污水排入城镇下水道水质标准3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1斑马鱼胚胎 zebrafish embryo未出壳膜的斑马鱼胚胎，一般指0 dpf3 dpf（days post fertilization；受精后天数）的斑马鱼胚胎。3.2斑马鱼仔鱼 zebrafish larva出壳膜后至发育到未成为幼鱼之前的斑马鱼，一般指4 dpf28 dpf的斑马鱼。3.3斑马鱼幼鱼 juvenile zebrafish外部形态与成鱼相似但未性成熟的斑马鱼，一般指 29 dpf84 dpf的斑马鱼。3.4成年斑马鱼 adult zebrafish性成熟、具备繁殖能力的斑马鱼。一般指年龄大于84 dpf的斑马鱼。4饲育鱼房工艺布局4.1饲育鱼房总体要求独立空间，净高度不宜低于250 cm；地面防潮、防水、防滑、耐冲击、平整；墙壁光滑、耐潮、不吸水、抗击碰性损坏、无缝隙。DBFORMTEXT32/TFORMTEXT3979FORMTEXT202124.2饲育鱼房功能分区包括去离子水制备区、循环系统流水处理区、饲育区、饵料生产区、储存区、清洁区、隔离区和实验区。4.2.1去离子水制备区将符合GB 5749生活饮用水卫生标准要求的水进行反渗处理制备成去离子水的区域，可位于饲育鱼房外独立空间。4.2.2循环系统流水处理区对饲育用水进行过滤、紫外消毒、充气、pH调节和电导率调节等集中区，可独立于饲育鱼房外。4.2.3饲育区日常繁育斑马鱼的饲育区应配备流水饲育设施饲育仔鱼、幼鱼与成年鱼；配备静水饲育设施饲育胚胎、仔鱼以及用于亲鱼繁育。4.2.4饵料生产区包括培育开口饵料草履虫的草履虫生产区和孵化丰年虫幼虫的丰年虫卵孵化区。分别配置供培育草履虫的容器和供孵化丰年虫卵的专用孵化设备。4.2.5储存区配备冰箱存放斑马鱼饵料。4.2.6清洁区设有清洁用水池以及鱼捞等渔具存放区。4.2.7隔离区外来的斑马鱼应饲养在独立于日常繁育饲育区之外的隔离区，胚胎经消毒处理后方可进入日常繁育饲育区。4.2.8实验区4.2.8.1进行实验处理的斑马鱼应饲育在独立于斑马鱼日常繁育饲育区外的实验区，可位于饲育鱼房外的实验室内。4.2.8.2仅为完成遗传改造而实施过显微注射的斑马鱼胚胎或仅用于简单显微形态学观测以评估质量的斑马鱼可回到日常繁育饲育区。4.2.8.3所有经实验处理的斑马鱼（包括胚胎、仔鱼、幼鱼和成鱼）不应回到日常繁育饲育区。完成实验后通常需要进行安乐死。5饲育设施5.1流水饲育系统5.1.1饲育架DB32/T 3979-20213应由不锈钢或其它防水防锈等无毒材料制成，层距不低于35 cm。5.1.2饲育缸5.1.2.1材质要求无毒、无害、无放射性、耐腐蚀、耐高温、耐高压、耐冲击、易清洗、易消毒灭菌。5.1.2.2饲育缸由饲育盖板、饲育缸体以及饲育后插板组成。5.1.2.3饲育盖板设饵料投喂孔、流水单管孔和备用孔。5.1.2.4饲育缸体配有双卡槽，可同时插入防仔鱼和幼鱼逃逸后插板以及导污后插板。5.1.3循环净化设备包括过滤处理单元、水体循环设备、消毒单元、充气补氧单元、PLC自动化控制集成单元、给排水分配单元、生物净化水槽、系统流量监控单元、pH控制单元和电导率控制单元。5.2静水饲育系统5.2.1饲育架同5.1.1。5.2.2交配缸内外胆结构，材料要求与饲育缸（5.1.2）一致；内胆底部高于外盒底部2 cm，并配有分离隔板和盖板。5.2.3饲育缸同5.2.2，但无内胆和分离隔板。6饲育环境条件6.1温度室温23 30，24 h内变动不超过2.5。水温25 29，24 h内变动不超过1.0。6.2湿度相对湿度为45%70%。6.3空气空气质量符合GB/T 18883室内空气质量标准。另需有新风输入，至少每4 h5 h 输入1次，每次空气交换量是整体空间的2倍体积。6.4环境噪音低于70 dB。6.5光照DBFORMTEXT32/TFORMTEXT3979FORMTEXT20214采用14 h光照10 h黑暗的方式饲养。光照时间内，饲育鱼房内和鱼缸水面光照强度均为54 lx324 lx。6.6饲育用水6.6.1电导率450 S/cm550 S/cm。6.6.2pHpH 6.5pH 8.0。6.6.3氨氮含量0.02 mg/l。6.6.4盐度含量为0.30.5。6.6.5亚硝酸盐含量0.2 mg/l。6.6.6硝酸盐含量5 mg/l。6.6.7溶解氧含量为5 mg/l8 mg/l。6.6.8二氧化碳含量为5 mg/l。6.6.9硬度50 mg/l100 mg/l。6.7流水循环速度小于10 dpf的仔鱼所在鱼缸的水流速度应小于10 ml/min，10 dpf至28 dpf仔鱼所在鱼缸的水流速度为50 ml/min80 ml/min，幼鱼和成鱼鱼缸水流速度100 ml/min150 ml/min。6.8日换水量6.8.1日排水量为系统总水量的 2%10%，根据系统中所负荷鱼量适当增加。6.8.2日常繁育斑马鱼的饲育用水符合 GB/T 31962污水排入城镇下水道水质标准，可直接排入城镇下水道。6.8.3实验区内用于斑马鱼实验处理的饲育用水应按照生物类实验室的要求处理，不应直接排入城镇下水道。7饲育密度与饵料及饲喂DB32/T 3979-202157.1饲育密度7.1.1胚胎饲育密度10 ml饲育用水饲育的胚胎数不超过50 枚。7.1.2仔鱼饲育密度4 dpf17 dpf仔鱼的饲育密度不超过40 尾/l、大于18 dpf的仔鱼饲育密度不超过20 尾/l。7.1.3幼鱼饲育密度不超过6 尾/l。7.1.4成鱼饲育密度5 尾/l。7.2饲育饵料7.2.1斑马鱼饵料包括草履虫活体和丰年虫幼虫活体，可自行培育或购买。7.2.2草履虫培育方法见附录 A。培育出的草履虫活体直接用于斑马鱼仔鱼的饲喂。7.2.3丰年虫幼虫孵化方法见附录 B。孵化出的幼虫经脱盐处理后用于斑马鱼的饲喂。7.3饲喂7.3.1饲喂总则斑马鱼的每日饲喂次数为2次4次。7.3.2饲喂量7.3.2.1发育时期为 4 dpf6 dpf 仔鱼，每次按草履虫 1105个/l3105个/l 投喂。发育时期为 7 dpf10 dpf 仔鱼，以草履虫和丰年虫幼虫混合喂饲，草履虫每次投喂密度为 3105个/l5105个/l，丰年虫为 1104个/l4104个/l，依发育时间逐步提高丰年虫比例。发鱼时期为11 dpf28 dpf 仔鱼，以丰年虫幼虫饲喂，饲喂量为约 3104个/l4104个/l。7.3.2.2幼鱼每次投喂丰年虫幼虫 5104个/l9104个/l。7.3.2.3成鱼每次投喂丰年虫幼虫 1105个/l3105个/l。8繁育和遗传资源保存8.1繁育安排使用交配缸进行斑马鱼交配繁育。亲本的雌雄比例为雌2尾雄1尾2尾，一个交配缸内最多不超过7尾鱼。8.2新创制遗传资源保存根据国家斑马鱼资源中心的要求填写相关表格，向国家斑马鱼资源中心递交新创制的基因组改造的详细遗传信息；同时递交新创制的基因型和遗传背景明确的斑马鱼成鱼，用于国家斑马鱼资源中心保存。DBFORMTEXT32/TFORMTEXT3979FORMTEXT202169伦理维护9.1福利保障应制定斑马鱼使用与管理的具体规章制度；不应执行任何不符合动物伦理学规范的斑马鱼使用与管理方案。9.2饲育人员技能斑马鱼生产与使用人员应在上岗前接受专业培训，了解斑马鱼繁殖生物学的基本知识、饲育规范以及使用与管理规范等。9.3生长记录记录每日的水温、室温、湿度、饲喂、清洁、整理、鱼缸清洗、受精卵收集、草履虫饲育和丰年虫幼虫孵化情况等。9.4标识黏贴在饲育缸或交配缸外的斑马鱼标签的信息应包括：动物的受精日期、基因型和传代代数等内容。9.5安乐死将斑马鱼置于冰水混合物中快速预冷2 min后，放入-20 冰箱冻存。斑马鱼安乐死后应及时转移至饲育鱼房外的专用斑马鱼尸体存放冰箱的冷冻室中冻存，集中进行无害化处理。10质量规范10.1实验用斑马鱼来源实验用斑马鱼的遗传背景应该明确。不应饲育遗传背景不明的斑马鱼；不应使用来源于宠物市场的斑马鱼。10.2胚胎的质量应具备与发育时期一致的正常的显微形态学特征。10.3仔鱼的质量10.3.1应从壳膜中孵出，具正常的显微形态学特征，可在水中自由游泳。10.3.24 dpf 仔鱼鱼鳔的后部腔室开始充气。约 20 dpf，仔鱼鱼鳔的前部腔室开始充气。约21 dpf 时，鱼鳔前后两个腔室的充气完成。10.4幼鱼与成鱼的质量10.4.1健康的斑马鱼应保持充分放松的姿态以与水面平行的方式在水中游泳。10.4.2斑马鱼的正常行为包括均匀的呼吸（通过活动鳃盖）、以及保持对游泳和捕食运动的兴趣。10.4.3斑马鱼生病的特征包括体重与体长的比例下降、急促的呼吸、明显的身体组织的损伤（溃DB32/T 3979-20217疡、外伤）、以及体色、体型和运动方式等的改变。当斑马鱼急速翻身、向一侧倾斜、或者与水面垂直也可以作为生病的特征。10.4.4表现出异于正常斑马鱼行为的基因组改造斑马鱼突变体，不应视作病鱼。10.4.5生病的斑马鱼通常要进行及时的安乐死。10.4.6如果病鱼十分珍贵，可将病鱼转移至隔离区隔离治疗。DBFORMTEXT32/TFORMTEXT3979FORMTEXT20218AA附录A（资料性）草履虫培育在3 l缸中加入0.1 g 氯化钠（分析纯）和约5粒大麦粒，倒入1.5 l2 l 煮沸去离子水后混匀，放置室温待用，待溶液降至室温后加入0.1 g酵母粉摇匀备用，吸取母液1