DB34T 2404-2015 猪丹毒杆菌检验规程.pdf

ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 24042015 猪丹毒杆菌检验规程 Protocol of examination for swine erysipelas 文稿版次选择 2015-07-14 发布 2015-08-14 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 24042015 I 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽农业大学、安徽省猪病监测工程技术中心提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省猪病监测工程技术中心。本标准主要起草人：李郁、孙裴、李泉生、钱昌银、魏建忠、檀华蓉、张联合。DB34/T 24042015 1 猪丹毒杆菌检验规程 1 范围 本标准规定了猪丹毒杆菌的检验方法。本标准适用于猪丹毒杆菌的检验。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 14926.43-2001 实验动物 细菌学检测 染色法、培养基和试剂 NY/T 566 猪丹毒诊断技术 3 设备和材料 3.1 显微镜：物镜 10 倍100 倍。3.2 电子天平：感量 0.1 g。3.3 恒温培养箱：361 3.4 冰箱：25。3.5 无菌培养皿：直径 90 mm。3.6 无菌试管：15 mm150 mm。3.7 无菌锥形瓶：容量 250 mL，500 mL。3.8 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。4 培养基与试剂 4.1 饱和氯化钠溶液：见附录 A 中 A.1。4.2 30甘油缓冲盐水溶液：见附录 A 中 A.2。4.3 革兰氏染色液：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 3.1 规定。4.4 血液琼脂培养基：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 4.4 规定。4.5 血清琼脂培养基：见附录 A 中 A.3。4.6 马丁肉汤：见附录 A 中 A.4。4.7 磷酸盐缓冲液（PBS）：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 4.13 规定。4.8 糖发酵培养基：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.1 规定。4.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.5 规定。4.10 营养明胶：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.14 规定。4.11 蛋白胨水：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.4 规定。4.12 硫酸亚铁琼脂：见附录 A 中 A.5。DB34/T 24042015 2 4.13 硝酸盐培养基与硝酸盐还原试剂：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.7 规定。4.14 氧化酶试剂：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.8 规定。4.15 胰蛋白胨水：见附录 A 中 A.6。4.16 马尿酸钠培养基：按照 GB/T 14926.43-2001 中的 5.18 规定。5 检验程序 猪丹毒杆菌检验程序见图1。图1 猪丹毒杆菌检验程序 6 操作步骤 6.1 采样、运输和保存 6.1.1 急性败血型猪丹毒可采取肾、脾、肝、心血、淋巴结；亚急性疹块型猪丹毒可采取疹块及其周围皮肤；慢性型猪丹毒可采取肿胀的关节液、心脏瓣膜增生物。6.1.2 脏器组织样品采集后需延迟送检的，可保存于饱和氯化钠溶液或 30甘油缓冲盐水溶液中，保存时间不超过 72 h。6.1.3 样品均需采取低温（04）保存和运输。6.2 显微镜检查 检 样显微镜检查分离培养生化反应动物试验血液或血清琼脂平板马丁肉汤临症表现病理变化染色镜检分离培养选取可疑菌落涂片镜检、纯培养直接涂片革兰氏染色镜检猪丹毒杆菌血清型鉴定结果报告PCR鉴定DB34/T 24042015 3 6.2.1 采集的样品制成涂片，革兰氏染色，镜检。6.2.2 猪丹毒杆菌形态学特征 革兰氏阳性小杆菌，在动物组织中呈断发状小短杆菌体，大小为 0.20.40.82.5 m，无芽孢，无荚膜，无鞭毛，常单独或排列成短链，在慢性病例的动物体内或陈旧培养基中呈现细长弯曲的长丝状。6.3 分离培养 6.3.1 对没有受污染的新鲜病料可直接接种在血液琼脂或血清琼脂培养基上，37培养 2448 h。或经马丁肉汤 37培养 24 h 后，再转种于血液琼脂或血清琼脂培养基上，37培养 24 h。6.3.2 如被检材料已腐败或被污染，可在上述培养基中加入 1/100 万结晶紫和 1/5 万叠氮钠，或加入新霉素（400 g/mL）或万古霉素（70 g/mL），抑制其他杂菌生长。6.3.3 在血清琼脂上菌落特征 细小、圆形、透明、凸起、灰白色、有光泽、质软、露珠样、易混悬于盐水中。6.3.4 在血液琼脂上菌落特征 同 6.3.3，并形成绿色的狭窄溶血环（溶血）。6.3.5 在马丁肉汤中生长特征 轻度混浊，振动试管呈现出云雾状，有少量灰白色粘稠沉淀，不形成菌膜和菌环。6.4 生化反应试验 糖发酵反应常不规则，一般可分解葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖，产酸不产气；不分解木糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖。产生硫化氢，不液化明胶，不使硝酸盐还原为亚硝酸盐，不形成靛基质，甲基红、V-P、接触酶、氧化酶试验均为阴性。6.5 动物试验 6.5.1 猪丹毒杆菌对小白鼠、大白鼠、家兔、鸽均有致病力，以小白鼠最敏感。6.5.2 将肾、脾、肝、淋巴结和疹块部皮肤磨碎，用灭菌生理盐水制成 1:51:10 组织悬液，或将24 h 的肉汤纯培养物做动物试验用。小白鼠皮下注射组织悬液 0.2 mL 或纯培养菌液 0.1 mL，接种后小鼠出现精神萎顿、拱背、毛乱、停食，37 天死亡；死亡的小鼠脾肿大，肺和肝充血，肝有时可见小点坏死。以死亡小鼠的心血或脏器制成涂片，革兰氏染色，镜检，可见大量猪丹毒杆菌；同时在血液琼脂或血清琼脂培养基上作分离培养，可见猪丹毒杆菌的典型菌落。6.6 PCR 鉴定 见附录B。6.7 血清型鉴定 若需鉴定血清型时可按照 NY/T 566 的规定执行。7 猪丹毒杆菌与产单核细胞李斯特菌鉴别要点 猪丹毒杆菌与产单核细胞李斯特菌均为革兰氏阳性的细小杆菌，形态很相似，因此在鉴定中应注意区别，两种细菌的区别应符合表1 的规定。DB34/T 24042015 4 表1 猪丹毒杆菌与产单核细胞李斯特菌鉴别要点 菌名 溶血型 4 生长 运动性（25）触酶 七叶苷水解 马尿酸钠 VP及甲基红试验 新生霉素 明胶穿刺 感染试验 鸽 豚鼠 猪丹毒杆菌 抵抗 试管刷状 产单核细胞李斯特菌 敏感 沿穿刺线生长 8 结果报告 8.1 综合以上形态、结构与染色，培养特性，生化反应，动物试验，PCR 鉴定，血清学分型鉴定及其与产单核细胞李斯特菌的鉴别结果，进行报告。8.2 符合 6.2、6.3、6.4、6.5，可确定为猪丹毒杆菌。8.3 符合 6.3、6.6，可确定为猪丹毒杆菌。8.4 符合 8.1、8.2，且根据 6.7，可确定为某种血清型的猪丹毒杆菌。DB34/T 24042015 5 A A 附 录 A（规范性附录）培养基的配制 A.1 饱和氯化钠溶液 A.1.1 成分 氯化钠 3839 g 蒸馏水 100 mL A.1.2 制法 将 3839 g 氯化钠加入 100 mL 蒸馏水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，分装于采样管，每管510 mL，121高压灭菌 15 min 备用。A.2 30甘油缓冲盐水溶液 A.2.1 成分 氯化钠 0.5 g 碱性磷酸钠 1.0 g 中性甘油 30 mL 蒸馏水 100 mL A.2.2 制法 先将盐类成分溶于水中，然后加入甘油，混匀，分装于采样管，每管 510 mL，121高压灭菌 15 min 备用。A.3 血清琼脂培养基 A.3.1 成分 营养琼脂 pH 7.6 100 mL 血清（兔、牛、羊或马）510 mL A.3.2 制法 将营养琼脂加热溶化，冷至约 55时，以无菌操作，加入无菌血清，然后倾注平皿备用。A.4 马丁肉汤 A.4.1 成分 蛋白胨液 500 mL DB34/T 24042015 6 肉浸液 500 mL 冰乙酸 1 mL 乙酸钠 6 g 葡萄糖 10 g A.4.2 制法 将蛋白胨液与肉浸液混合，加热至 80，加冰乙酸 1 mL，摇匀，再煮沸 5 min。加 15氢氧化钠约 20 mL，校正 pH 7.2。加乙酸钠 6 g，再校正 pH 7.2。继续煮沸 10 min，用滤纸过滤，每 1000 mL 滤液加葡萄糖 10 g，然后装瓶，每瓶 500 mL。121高压灭菌 15 min 备用。A.5 硫酸亚铁琼脂 A.5.1 成分 酵母浸膏 3 g 蛋白胨 10 g 硫酸亚铁 0.2 g 硫代硫酸钠 0.3 g 氯化钠 5 g 琼脂 12 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.4 A.5.2 制法 加热溶解，校正 pH，分装试管，115高压灭菌 15 min，取出直立候其凝固。A.6 胰蛋白胨水 A.6.1 成分 胰蛋白胨 10 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.0 A.6.2 制法 将上述成分溶解，校正 pH，分装试管。121高压灭菌 15 min 备用。DB34/T 24042015 7 B B 附 录 B（规范性附录）猪丹毒杆菌聚合酶链式反应（PCR）鉴定 B.1 材料准备 B.1.1 主要仪器 PCR 扩增仪、1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR 反应管、水浴锅、高速冷冻离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、移液器吸管。B.1.2 主要试剂 2PCR Master Mix、双蒸水、琼脂糖、10 mg/ML 溴化乙锭（EB）、TBE 缓冲液、上样缓冲液（10Loading Buffer）、相对分子质量 Marker（DL-2000）。B.1.3 引物序列 P1：5-CGATTATATTCTTAGCACGCACGCAACG-3 P2：5-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG-3 B.2 操作步骤 B.2.1 细菌基因组 DNA 的提取 采用煮沸法。即取 1 mL 过夜培养菌液加入 1.5 ml 离心管中，以 12000 r/min 离心 10 min，弃上清液，加入 30 L 双蒸水混均，置沸水中煮沸 10 min，之后冰浴 10 min，再以 12000 r/min 离心 10 min，取上清液即为 DNA 模板。B.2.2 PCR扩增 检测过程应同时做阳性和阴性空白对照。阳性对照模板为猪丹毒杆菌（G4T10），阴性空白对照为灭菌超纯水。PCR 反应体系：总体积为 25 L，其中含有 12.5 L 的 PCR Master Mix，10 mol/L 上、下游引物各 1 L，1 g/L DNA 模板 5 L，灭菌双蒸水 5.5 L。PCR 扩增参数：95预变性 5 min；95变性 1 min，63退火 1 min，72延伸 1 min，共 40个循环；最后 72 10 min。B.2.3 PCR扩增产物电泳检测 用 100ML 1TAE 缓冲液制备 1.0琼脂糖凝胶，加入 5 L 10 mg/ML EB。取 5 L PCR 扩增产物与 1 L 10Loading Buffer 混合后加入点样孔进行电泳，电压 100V，电流 100A，电泳 30 min。用凝胶成像仪观察、拍照、记录电泳结果。B.2.4 结果判定 DB34/T 24042015 8 目的基因大小为 937 bp。阳性对照扩增出 937 bp，阴性空白对照孔未见有 PCR 扩增条带，表明试验成立，否则应重做。试验成立，被检样品孔如发现有 937bp 大小的扩增条带，则判定阳性（），猪丹毒杆菌 PCR 检测结果电泳图见图1；被检样品孔如未发现有 937bp 大小的扩增条带，则判为阴性（）。_ 937bp M 1 2 3 4 2000 1000 750 500 250 100 图1 猪丹毒杆菌PCR检测结果电泳图