DB32T 2607-2013 猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与猪A群轮状病毒检测技术 多重RT-PCR法.pdf

ICS65.020.30 B22 备案号：40493-2014 江苏省地方标准 DB32DB32/T 2607-2013 猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与猪 A 群轮状病毒检测技术 多重 RT-PCR 法 Method of a Multiplex Reverse Transcription-PCR for Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus，Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus and Porcine Group A Rotavirus 2013-12-20 发布 2014-01-20 实施江苏省质量技术监督局 发 布 DB32/T 2607-2013 前 言 为规范猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与猪轮状病毒分子生物学检测技术，提高猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与猪轮状病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写编写。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：郭容利、何孔旺、倪艳秀、俞正玉、茅爱华、李彬、温立斌、王小敏。DB32/T 2607-2013 1 猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与猪 A 群轮状病毒 检测技术 多重 RT-PCR 法 1 范围 本标准规定了猪流行性腹泻，猪传染性胃肠炎与猪 A 群轮状病毒分子生物学检测技术 RT-PCR 的所用引物大小、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。本标准适用于猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎与猪 A 群轮状病毒的 RT-PCR 检测。本标准适用于猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎与猪 A 群轮状病毒实验室诊断、流行病学调查。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB 165482006 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 NY/T 5412002 动物疫病实验室检验采样方法 3 主要试剂 3.1 DNA Marker DL-2000 3.3 TRIzol 3.4 DEPC 3.5 小量胶回收试剂盒 3.6 氯仿 3.7 异丙醇 3.8 无水乙醇 3.9 反转录试剂盒 3.10 HSTM Mix 4 引物 根据GenBank上公布的PEDV核蛋白N基因序列，TGEV糖膜蛋白M基因序列，猪A群轮状病毒（PARV）内衣壳蛋白VP6基因序列，分别在其保守区设计一对特异性引物见表1。表1 引物序列表 引物 引物序列 PCR产物长度 bp 退火温度 PEDV N1 5-gcatttctactacctcggaa-3 750 54 PEDV N2 5-gcgatctgagcatagcctga-3 TGEV M1 5-gcgtctgattgtgagtcatg-3 544 54 TGEV M2 5-aatagtcctgctgggtaatg-3 PRVP61 5-cagcgtactggattcgtgtt-3 275 54 PRVP62 5-tcttgggaaactgaacctct-3 5 样品 DB32/T 2607-2013 2 5.1 阳性病毒样品的取样 5.1.1 PEDV CV777 疫苗毒株，VERO 细胞培养。5.1.2 TGEV JSXB2010 细胞毒，ST 细胞培养。5.1.3 PARV Nan86 细胞毒，Marck145 细胞培养。上述三种病毒按 107 TCID50/ML 等量混合后备用做阳性样品。上述三种细胞加培养液冻融三次后等量混合后备用做阴性对照。5.2 粪便与组织样品的处理 按照NY/T 541-2002动物疫病实验室检验采样方法，采集腹泻猪的粪便或肠组织样品，在粪便或研磨好的小肠组织中按1：10加入DEPC水，剧烈震荡使其混和均匀，5000 rpm，离心20 min，取上清于-20备用。反复冻融三次后，以5000 rpm，离心20 min，取上清。对每个样品进行编号标记。另外，按照GB 165482006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程处理待检粪便或组织样品。5.3 细胞培养物样品的处理 细胞培养物反复冻融三次后，以12000 rpm，离心20 min，取上清。阴阳性细胞培养物对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。6 RNA 的提取 在被检样品与200L上清中加入TRIzol 800 L，振荡混匀后，室温放置5 min，加入氯仿200 L，剧烈振荡后，室温放置10 min，4 12000 rpm，离心10 min，取上清，加入0.5 mL异丙醇，混匀，-20放置2 h以上，4 12000 rpm离心15 min，去上清，沉淀用1 ml 75%的无RNA酶的乙醇洗涤，4 7500 rpm离心5 min，去上清，室温干燥RNA沉淀20 min，加入DEPC水20 L，使充分溶解，-20 冻存备用。7 RT-PCR 7.1 反转录反应 表2 反转录反应 组分 体积 10X反转录缓冲液 2 uL dNTP （10mM）2 uL MgCl2,（25mM）3 uL RNasin 0.5 uL AMV 反转录酶 0.5 uL 随机引物 1.0 uL RNA 2 uL 加无RNA酶的ddH2O（DEPC水）9 uL 终体积为 20 uL 瞬间离心混匀，25反应 15min，42 孵育 60 min，95 5min，同时设立阴性、阳性对照，cDNA产物于-20 保存备用。7.2 PCR 反应 表3 PCR反应 组分 体积 cDNA 2 uL PEDVN1/PEDVN2（20pmoluL-1）0.5 uL/0.5 uL TGEVM1/TGEVM2（20pmoluL-1）0.5 uL/0.5 uL PRVP61/PRVP62（20pmoluL-1 1）0.25 uL/0.25 uL 2HSTMMix 12.5 uL ddH2O（DEPC 水）补足至 25 uL DB32/T 2607-2013 3 表 4 反应条件 温度 时间 备注 95 3 min 95 30 sec 35 Cycles 54 30 sec 72 45 sec 72 10 min 4 保存 7.3 结果观察 将PCR反应产物于1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120V，时间30min，紫外灯下观察结果,并进行拍照。7.4 结果判定 以阳性病毒作为阳性对照,以培养病毒细胞作为阴性对照，灭菌水作空白对照，做RT-PCR，所有样品同时电泳。阳性对照有三条750bp、544bp、275bp左右的目的条带，分别对应PEDV 或TGEV或PARV，阴性对照、空白对照无相应的目的条带的情况下，检测样品出现与阳性对照相同目的条带的判为阳性，即该粪便为PEDV 或TGEV或PARV核酸阳性；检测样品未出现与阳性对照相同目的条带的判为阴性。即该粪便为PEDV、TGEV和PARV核酸阴性。如果阳性对照无相应的目的条带，可能是存在操作失误，该试验需要做重复试验；如果阴性对照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该试验需要做重复试验。8 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。