DB32T 1775-2011 Ⅰ型鸭肝炎病毒的检测 RT-PCR方法.pdf

ICS 65.020.30B 41备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T17752011型鸭肝炎病毒的检测RT-PCR 方法Method of RT-PCR detecting Duck Virus Hepatitis I2011-05-06 发布2011-07-06 实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T 17752011I前言为规范型鸭肝炎病毒分子生物学检测技术，提高鸭肝炎病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准结构和编写编制。本标准的附录 A 为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：魏雪涛、李银、刘宇卓、张敬峰。DB32/T 177520111型鸭肝炎病毒的检测RT-PCR 方法1范围本标准规范了型鸭肝炎病毒分子生物学检测技术RT-PCR的所用引物大小、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。本标准适用于检测鸭肝脏和病毒尿囊液中 I 型鸭肝炎病毒核酸。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T 541-2002动物疫病实验室检验采样3方法原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR技术却以其快速、敏感和特异等优点在动物疫病检测中得到广泛应用，而且随着PCR技术的不断改进，这种针对病原核酸的诊断方法表现出更准确、灵敏和特异的特点。本标准选取了DHV I VP1基因的保守，设计了一对特异性引物，经过了PCR条件的优化、特异性实验、敏感性试验等，对DHV I的鉴定具有很高的准确性。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备：PCR仪，离心机，电泳槽，微量移液器，凝胶成像系统4.2主要试剂：TRIZOL，氯仿，异丙醇，无水乙醇，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水，AMV反转录酶，5AMV Buffer，10 mmol/L dNTPs，RNA酶抑制剂，25 mmol/L MgCl2，EX Taq DNA聚合酶，10EX Taq DNA聚合酶buffer，2.5 mmol/L dNTP，DNA Marker DL-2000，琼脂糖。5引物上游引物：5-ATCTAATGTCCCGATACAAGGTG-3；下游引物：5-ACGCTAGTGTTTTGAGTCTAAGGC-3。6样品采集按照NY/T 541-2002动物疫病实验室检验采样方法，病死或扑杀鸭，无菌采集肝脏组织。7方法步骤DB32/T 177520112试验用水：按照GB-T 6682-2008 三级水标准7.1样品处理取病料0.5g1g置研钵中剪碎并研磨，反复冻融研磨，将研磨好的组织，用生理盐水15稀释，以4 12000 r/min 离心10 min，取上清200 L备用。阴性对照：没有发病的正常鸭肝脏阳性对照：用中和试验检测DHV阳性肝脏样品（见附录A）7.2DHV RNA 的提取取已处理的待检样品，以DHV阳性病毒为阳性对照，以正常肝脏作为阴性对照，无菌水为空白对照，每管依次加入Trizol600L，振荡混匀后，室温放置10 min，加入氯仿200 L，剧烈振荡后，室温放置1 min，4 12000 r/min，离心15 min，取上层水相750 L，加入500 L异丙醇，混匀，20放置15 min，4 12000 r/min,离心15 min，去上清，缓缓加入75%乙醇1 mL洗涤，4 8000 r/min离心5 min，去上清，室温干燥RNA样品沉淀20 min，加入DEPC水10 L，使充分溶解。7.3RT-PCR反转录反应：5AMV Buffer 4 L、10 mmol/L dNTPs 2 L、下游引物 1 L、RNA 酶抑制剂 0.5L、RNA 模板 10L，AMV 反转录酶 0.5L，H2O（DEPC 处理）2 L，总体积为 20 L，瞬间离心混匀，65反应 15 min，42孵育 1 h，95 5 min，同时设立阴性、阳性对照，产物于20保存备用。PCR 的反应：按 25 L 体系进行，含 MgCl2（25 mmol/L）1.5 L，灭菌水 15 L，反转录产物 4 L，10EXTaqDNA 聚合酶 buffer 2.5L，2 mmol/L dNTP 0.5 L，上、下游引物 50 pmol/L 各 0.5 L，EXTaqDNA 聚合酶 0.5 L。94 3 min，然后进入循环 94 30 s，52 30 s，72 30 s，30 个循环，于 72延伸 10 min，4保存。7.4结果观察将PCR反应产物于1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120 V，时间30 min，紫外灯下观察结果，并进行拍照。8结果判定在阳性对照出现相应扩增带、阴性对照无此扩增带是判定结果。检测样品出现与阳性对照相同目的条带大小为365bp的扩增片段是，判定为该样品为I型鸭肝炎核酸阳性；否则判定维阴性。如果阳性对照无相应的目的条带，可能是存在操作失误，该试验需要做重复试验；如果阴性对照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该试验需要做重复试验。DB32/T 177520113附 录 A(规范性附录)阳性样品的制备用中和试验检测DHV阳性肝脏样品，阳性样品按如下方法制备：首先，无菌采集新鲜DHV阳性鸭肝脏，用无菌的剪刀剪碎并称量，然后以质量比15加入DEPC（diethypyrocarbonate 焦碳酸二乙酯）水，研磨成悬液，装入用DEPC处理过的离心管中，于20反复冻融3次，以12000 r/min，冷冻离心20 min，取上清接种11日龄鸭胚，0.1 mL/枚。置37 恒温箱继续培养，每天照蛋观察3次。弃去24 h前死亡胚，无菌收获24120 h死亡胚液，无菌分装，并进行病毒效价测定，病毒含量（EID50）达到10-3/0.1mL以上，即可作为阳性对照，20保存备用。