DB32T 2608-2013 猪流行性乙型脑炎诊断技术.pdf

ICS65.020.30 B22 备案号：40494-2014 江苏省地方标准 DB32DB32/T 2608-2013 猪流行性乙型脑炎诊断技术 Diagnostic Techniques for Japanese Encephalitis of Swine 2013-12-20 发布 2014-01-20 实施江苏省质量技术监督局 发 布 DB32/T 2608-2013 前 言 为规范猪乙型脑炎诊断技术，特制定本标准。本标准按GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写进行编制。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：张雪寒、何孔旺、王小敏、郭容利、倪艳秀、李彬、温立斌、周俊明、俞正玉。DB32/T 2608-2013 1 猪乙型脑炎诊断技术 1 范围 本标准规定了猪乙型脑炎的诊断技术。本标准规定的分离鉴定，间接免疫荧光技术和RT-LAMP法适用于本病的确诊，RT-LAMP适用于大批量样品的普查。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18638 流行性乙型脑炎诊断技术 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 3 流行病学诊断 3.1 易感动物 多种动物可感染乙型脑炎病毒，多呈隐性感染，但可成为传染源。猪是乙型脑炎的重要传染源，不同年龄段的猪均能够感染，但临床症状有所不同。成年猪感染后可造成严重的生殖障碍。3.2 易感季节 本病的发生有明显的季节性，每年7-9月份发病率最高。3.3 传播媒介 蚊虫叮咬是乙型脑炎病毒传播的主要媒介。消灭传播媒介蚊虫是本病的主要预防措施。4 临床诊断 猪流行性乙型脑炎是一种发病率高死亡率低的繁殖障碍性传染病，临床症状为高热、沉郁或狂暴、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭和脑膜刺激症。感染乙脑病毒病猪症状主要表现为繁殖障碍:母猪表现为流产、死胎、木乃伊胎；公猪多表现为单侧睾丸炎，精液品质不良，失去配种能力。5 病理学诊断 公猪睾丸不同程度肿大，切面可见睾丸实质充血、出血，并有许多颗粒状的突起，有明显的黄色坏死灶。慢性病例睾丸内萎缩硬化，缩到如鸡蛋大，与阴囊粘连，睾丸实质大部分结缔组织化。流产母猪子宫内膜显著充血，粘膜上覆有粘稠的分泌物，膜面有少数小点状出血。子宫粘膜下组织水肿，胎盘呈炎性浸润。本死胎很少发生腐败。一般在体躯后部皮下有弥漫性水肿，全身肌肉退色，好像水煮肉。胸腔和心包常有积液，实质器官浊肿及散发小出血点。脑膜和脊髓硬膜有出血。DB32/T 2608-2013 2 6 病原学诊断 6.1 病毒分离 6.1.1 材料准备 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 66822008的灭菌二级水。PBS，DMEM，兔抗猪乙型脑炎病毒高免血清和健康兔血清。6.1.2 病料采集 按NY/T 541规定的方法采样。疑似JE病例，流产胎儿、死胎、木乃伊胎等的脑组织，以及公猪精液和猪舍蚊子等靶组织样品。将猪脑组织或蚊子（50-100只/次）分别置于研钵中，加入PBS反复研磨，直至样品研磨成匀浆、组织碎片基本消失为止。将研磨液分装于1.5 mL EP管中，-70 冰箱反复冻融3次，4 12000 r/min离心5 min，取上清液，经一次性滤器（孔径0.22 m）过滤后，-70保存备用。公猪精液的预处理仅是省去研磨过程，其他步骤与猪脑组织或蚊子的预处理一致。6.1.3 细胞培养 取培养至单层的BHK-21细胞，用PBS洗3次后，加入过滤的病料上清液1.01.2 mL，37细胞培养箱中吸附1.5 h，期间每隔20 min轻摇细胞瓶1次。弃上清液，用PBS洗1次后加入2%维持液，置5%CO2、37 细胞培养箱中培养35 d，每天观察细胞病变（CPE）。如无CPE则于接毒后5 d收毒，盲传35代。6.1.4 乳鼠接种 每只乳鼠脑内接种30.0 L或脑内兼腹腔各注射30.0 L过滤的病料上清，对照组脑内注射生理盐水30.0 L。每天观察小鼠精神状态23次，连续23周。待小鼠出现神经症状后（若无症状者则于接毒3周后）无菌剖取鼠脑，加入适量PBS研磨成乳液，反复冻融离心后，取上清液用0.22 m滤器过滤，再次接种乳鼠连续传代。6.2 病毒鉴定 6.2.1 免疫荧光鉴定 在 24 孔细胞培养板中接毒，培养 4872 h 后，弃原液，用 PBS 冲洗后加入-20 预冷的丙酮，室温下固定 10 min；PBS 冲洗，加入稀释好的猪 JEV 阳性血清，置 37湿盒中孵育 1 h；PBS 冲洗，加入已稀释的荧光素标记的兔抗猪抗体，37湿盒中作用 1h；PBS 冲洗后加入甘油缓冲液，于倒置荧光显微镜下观察。同时设阴性对照。6.2.2 反转录-环介导等温扩增法（RT-LAMP）鉴定 上述制备的病料，用商品化试剂盒提取RNA，作为RT-LAMP模板。根据JEV囊膜糖蛋白E基因6个特异性区域设计4条引物：F3和B3为外引物；FIP和BIP为内引物。F3：5-CAACATTGCACGTCCGCAT-3；B3：5-AAGTCCACATCCGATGCC-3；FIP：5-CCACCGTCGAGTTGTCAGTGACTTTTCGAAGCTAGCGAACTTGCT-3；BIP：5-CACGACTGGAGATGCGCACAATTTTCCCACGGTCACTGAAGCCTT-3。外引物扩增产物为245bp。LAMP扩增产物在电泳图谱上表现为大小不一的梯状条带。RT-LAMP的扩增条件：65水浴锅中放置70min。优化后的反应体系中：含有0.2M F3、B3，2M FIP、BIP，0.8M dNTPs，20mM Tris-HCl（pH8.8），10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，6mM Mg2+，0.1%Triton X-100，1.1mM甜菜碱，8U BST 聚合酶，1U AMV反转录酶，再加入5L的模板RNA。加入钙黄绿素荧光染料，肉眼观察结果，绿色，判为阳性，橙色，判为阴性。以1.5琼脂糖凝胶电泳，出现梯状条带，判为阳性，无条带，判为阴性。并用建立的RT-LAMP方法扩增猪瘟（CSFV），蓝耳病毒（PRRSV），圆环病毒（PCV2）、伪狂犬病毒（PRV）、细小病毒（PPV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、传染性腹泻病毒（PEDV）和轮状病毒（RV）以检验其特异性。DB32/T 2608-2013 3 6.3 结果判定 以上实验为阳性，判为猪乙型脑炎病毒。7 最终结论判定 下列任何情况之一，均可判为猪乙型脑炎：7.1 发病有明显季节性，并主要发生在夏季，以7-9月份为主、个体临床表现明显，病例解剖病变典型，用第6章中任何一种试验确诊为猪乙型脑炎病毒阳性者。7.2 临床症状和发病情况不详，群体解剖检查病变典型，用第6章中任何一种实验确诊为猪乙型脑炎病毒阳性者。7.3 发病情况、临床症状、病理变化不详，如用第6章中任何一种实验确诊为猪乙型脑炎病毒阳性者。