ICS65.020.30B41备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T1769—2011马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法MethodofPCRfordetectingStreptococcuszooepidemicus2011-05-06发布2011-07-06实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1769—2011I前言为规范马链球菌兽疫亚种分子生物学检测技术，提高马链球菌兽疫亚种检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编写。本标准的附录A为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：倪艳秀、何孔旺、吕立新、张雪寒、周俊明、俞正玉、茅爱华、温立斌、郭容利、李成仁、李彬、王小敏。DB32/T1769—20111马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法1范围本标准规定了马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法所用的仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施等技术标准。本标准适用于马链球菌兽疫亚种的PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引物文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3原理PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。本标准根据GenBank上公布的马链球菌兽疫亚种类M蛋白基因序列，在其保守区设计一对特异性引物，经过了PCR条件的优化、特异性实验、敏感性实验等，对马链球菌兽疫亚种的鉴定具有很高的准确性。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备4.1.1高速离心机4.1.2水浴锅4.1.3PCR仪4.1.4核酸电泳仪4.1.5凝胶成像系统4.2主要试剂除另有规定，所用试剂均为分析纯。4.2.1生理盐水4.2.2蛋白酶K4.2.3Taq酶4.2.4dNTP4.2.5琼脂糖，电泳级5引物DB32/T1769—20112上游引物：5′-GCAGCCCTCTTGGTTGGT-3′；下游引物：5′-CTGCGTCAGCGTCTCCAT-3′。6方法步骤试验用水：按照GB/T6682-2008三级水标准。6.1样品处理6.1.1病料样品处理采用差速离心法：取约5g病料，剪碎研磨，用5mL生理盐水混悬，先2000r/min离心2min，去除大组织块，取上清液，后10000r/min离心5min，弃上清液，沉淀以灭菌水重悬，备用。6.1.2可...
