DB32T 1769-2011 马链球菌兽疫亚种的检测 PCR方法.pdf

ICS 65.020.30B 41备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T17692011马链球菌兽疫亚种的检测PCR 方法Method of PCR for detecting Streptococcus zooepidemicus2011-05-06 发布2011-07-06 实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T 17692011I前言为规范马链球菌兽疫亚种分子生物学检测技术，提高马链球菌兽疫亚种检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写编写。本标准的附录 A 为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：倪艳秀、何孔旺、吕立新、张雪寒、周俊明、俞正玉、茅爱华、温立斌、郭容利、李成仁、李彬、王小敏。DB32/T 176920111马链球菌兽疫亚种的检测PCR 方法1范围本标准规定了马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法所用的仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施等技术标准。本标准适用于马链球菌兽疫亚种的 PCR 检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引物文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3原理PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA 的过程。是一项 DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的 DNA。本标准根据GenBank 上公布的马链球菌兽疫亚种类 M 蛋白基因序列，在其保守区设计一对特异性引物，经过了 PCR条件的优化、特异性实验、敏感性实验等，对马链球菌兽疫亚种的鉴定具有很高的准确性。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备4.1.1高速离心机4.1.2水浴锅4.1.3PCR仪4.1.4核酸电泳仪4.1.5凝胶成像系统4.2主要试剂除另有规定，所用试剂均为分析纯。4.2.1生理盐水4.2.2蛋白酶K4.2.3Taq 酶4.2.4dNTP4.2.5琼脂糖，电泳级5引物DB32/T 176920112上游引物：5-GCAGCCCTCTTGGTTGGT-3；下游引物：5-CTGCGTCAGCGTCTCCAT-3。6方法步骤试验用水：按照GB/T 6682-2008 三级水标准。6.1样品处理6.1.1病料样品处理采用差速离心法：取约 5 g 病料，剪碎研磨，用 5 mL 生理盐水混悬，先 2000 r/min 离心 2 min，去除大组织块，取上清液，后 10000 r/min 离心 5 min，弃上清液，沉淀以灭菌水重悬，备用。6.1.2可疑培养物样品处理取可疑培养物 1 mL 10000 r/min 离心 5 min，弃上清，沉淀以 200 L 灭菌水重悬，备用。阴性对照：液体培养基。阳性对照：马链球菌兽疫亚种液体培养物。阴性、阳性对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。6.2DNA提取取 ddH2O 溶解的样品，每 200L 加入 3L 蛋白酶 K（20mg/mL），42作用 1 h，煮沸 5 min，10 000rmin 离心 5 min，上清作为模板。6.3PCR扩增6.3.1反应条件按 25 L 体系进行，10 buffer 2.5L，MgCl2（25 mM）1.5L，dNTP（2.5 mM）1.0L，上游引物（50 pmol/L）0.5L，下游引物（50 pmol/L）0.5L，模板 DNA 3.0L，Taq 酶（5 U/L）0.5L，灭菌水 15.5L。按如下条件进行 PCR 反应。95 5 min，然后进入循环 94 1 min，60.2 1 min，72 1 min，35 个循环，于 72 延伸 10 min，4 保存。6.3.2电泳将 PCR 反应产物于 1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为 120 V，时间 30 min。6.3.3结果观察用凝胶成像系统观察结果，并进行拍照。7结果判定7.1试验结果成立条件阳性对照的PCR产物电泳后在364 bp的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立；否则，结果不成立。7.2结果判定7.2.1在试验结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在364 bp的位置上出现一条特异性条DB32/T 176920113带，判为阳性，即该样品为马链球菌兽疫亚种核酸阳性。7.2.2在试验结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在364 bp的位置上未出现一条特异性条带，判为阴性，即该样品为马链球菌兽疫亚种核酸阴性。7.2.3如果阳性对照无相应的目的条带，可能是存在操作失误，该试验需要做重复试验；如果阴性对照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该试验需要做重复试验。8废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录 A。DB32/T 176920114附 录 A(规范性附录)检测过程中防止交叉污染的措施A.1抽样和制样过程抽样和制样工具，应清洗干净，121,1520 min灭菌，一套清洁工具限于一个样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、灭菌，或为一次性灭菌容器。A.2检测过程A.2.1PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区、后PCR区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单方向进行。A.2.2实验过程中，应穿实验服和戴手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。A.2.3各区所有的试剂、器材(尤其是移液器)、仪器都应专用，不得带出该区。A.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121,1520 min灭菌，避免核酸和(或)核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在2025 贮存的试剂中，可加0.025%的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。A.2.5装有DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。A.2.6前PCR区中，最好能在PCR操作箱中加人PCR反应各组分。A.2.7实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA。A.2.8可使用UDG和dUTP系统控制污染。