DB32T 1770-2011 A群猪轮状病毒的检测 RT-PCR方法.pdf

ICS 65.020.30B 41备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T17702011A 群猪轮状病毒的检测RT-PCR 方法Method of RT-PCR for detecting Porcine Rotavirus group A2011-05-06 发布2011-07-06 实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T 17702011I前言为规范 A 群猪轮状病毒分子生物学检测技术，提高 A 群猪轮状病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写编写。本标准的附录 A 为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：倪艳秀、何孔旺、郭容利、温立斌、吕立新、张雪寒、周俊明、李成仁、俞正玉、茅爱华、李彬、王小敏。DB32/T 177020111A 群猪轮状病毒的检测RT-PCR 方法1范围本标准规定了A群猪轮状病毒的检测 RT-PCR方法的所用仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施等技术标准。本标准适用于A群猪轮状病毒的RT-PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引物文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 16548-2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T 541-2002动物疫病实验室检验采样方法3原理RT-PCR 是将 RNA 的反转录（RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从 RNA 合成 cDNA，再以 cDNA 为模板，扩增合成目的片段。本标准根据 GenBank 上公布的 A群猪轮状病毒（PRV）衣壳蛋白 VP7 基因序列，在其保守区设计一对特异性引物，先提取待检样品的 RNA，用下游引物进行 RT，再以 cDNA 为模板进行 PCR。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备4.1.1高速离心机4.1.2PCR仪4.1.3核酸电泳仪4.1.4凝胶成像系统4.2主要试剂除另有规定，所用试剂均为分析纯。4.2.1焦碳酸二乙酯(DEPC)水4.2.2TRIzol4.2.3RNA酶抑制剂4.2.4AMV反转录酶4.2.5Taq 酶4.2.6dNTP4.2.7琼脂糖，电泳级DB32/T 1770201125引物上游引物：5-GTATGGTATTGAATATACCAC-3；下游引物：5-GATCCTGTTGGCCATCC-3。6方法步骤试验用水：按照GB/T 6682-2008 三级水标准。6.1样品处理6.1.1粪便样品的处理按照NY/T 541-2002，采集腹泻猪的粪便，在粪便中按1：10加入DEPC水，剧烈震荡使其混和均匀，5000 r/min，离心20 min，取上清于-20 备用。反复冻融三次后，以5000 r/min，离心20 min，取上清。阴性粪便对照：正常猪粪便。阳性粪便对照：感染A群猪轮状病毒的猪粪便。阴性、阳性粪便对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。另外，按照GB 16548-2006 处理待检粪便。6.1.2可疑细胞培养物样品的处理可疑细胞培养物反复冻融三次后，以5000 r/min，离心20 min，取上清。阴性细胞培养物对照：正常MA104细胞。阳性细胞培养物对照：A群猪轮状病毒细胞培养物。阴性、阳性细胞培养物对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。6.2RNA的提取在200 L上清中加入TRIzol 800 L，振荡混匀后，室温放置5 min，加入氯仿200 L，剧烈振荡后，室温放置10 min，4 12000 r/min，离心10 min，取上清，加入0.5 mL异丙醇，混匀，-20放置2 h以上，4 12000 rpm离心15 min，去上清，沉淀用1ml 75%的无RNA酶的乙醇洗涤，4 7500 r/min离心5 min，去上清，室温干燥RNA沉淀20 min，加入DEPC水12 L，使充分溶解，-20 冻存备用。6.3RT-PCR6.3.1反应条件反转录反应：按 20L 体系进行，5Buffer 4.0L、dNTP（10 mM）2.0L、下游引物（50 pmol/L）1.0L、RNA 酶抑制剂 0.5L、RNA 模板 12.0L，AMV 反转录酶 0.5L，瞬间离心混匀，65 反应 15 min，42 孵育 1 h，95 5 min，同时设立阴性、阳性对照，产物于-20 保存备用。PCR 反应：按 25L 体系进行，10 buffer 2.5L，MgCl2（25 mM）1.0L，dNTP（2.5 mM）1.0L，上游引物（50 pmol/L）0.5L，下游引物（50 pmol/L）0.5L，模板 DNA 3.0L，Taq 酶（5 U/L）0.5L，灭菌水 16.0L。按如下条件进行 PCR 反应。95 5 min，然后进入循环 94 1 min，55.0 1 min，72 1 min，35 个循环，于 72 延伸 10 min，4 保存。6.3.2电泳将 PCR 反应产物于 1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为 120 V，时间 30 min。DB32/T 1770201136.3.3结果观察用凝胶成像系统观察结果，并进行拍照。7结果判定7.1试验结果成立条件阳性对照的PCR产物电泳后在342 bp的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立;否则，结果不成立7.2 结果判定7.2.1在试验结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在342 bp的位置上出现一条特异性条带，判为阳性，即该样品为A群猪轮状病毒核酸阳性。7.2.2在试验结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在342 bp的位置上未出现一条特异性条带，判为阴性，即该样品为A群猪轮状病毒核酸阴性。7.2.3如果阳性对照无相应的目的条带，可能是存在操作失误，该试验需要做重复试验；如果阴性对照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该试验需要做重复试验。8废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录A。DB32/T 177020114附 录 A(规范性附录)检测过程中防止交叉污染的措施A.1抽样和制样过程抽样和制样工具，应清洗干净，121,1520 min灭菌，一套清洁工具限于一个样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、灭菌，或为一次性灭菌容器。A.2检测过程A.2.1PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区、后PCR区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单方向进行。A.2.2实验过程中，应穿实验服和戴手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。A.2.3各区所有的试剂、器材(尤其是移液器)、仪器都应专用，不得带出该区。A.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121,1520 min灭菌，避免核酸和(或)核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在2025 贮存的试剂中，可加0.025%的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。A.2.5装有DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。A.2.6前PCR区中，最好能在PCR操作箱中加人PCR反应各组分。A.2.7实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA。A.2.8可使用UDG和dUTP系统控制污染。DB32/T 177020115附 录 B(规范性附录)RT-PCR 扩增产物参考序列本标准参照的序列为GenBank上公布的PRV 衣壳蛋白(vp7)部分基因序列(ORF 2-342bp)1EF474079（阿根廷）Gtatggtattgaatataccacaattctaatcttcttgacatcgattacattgctaaattatatcttaaaatcaataacaagagtaatggactatataatttacagatttctgcttatagtggtaatcttggccaccatgataaatgcgcagaattatggagtgaatttgccaattacaggttcaatggatactgcatacgcaaattctacgcaaagtgagccatttttaacatcaactctttgtttgtattatcctgttgaggcatcaaacgaaatagctgatactgaatggaaagatcccttatcacaactgttcttgacaaaaggatggccaacaggatc