DB32T 3775-2020 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法.pdf

ICS 65.020.20B 31DB32江苏省地方标准DB 32/T 37752020猪繁殖与呼吸综合征病毒 RT-LAMP 检测方法RT-LAMP method for Detectiong Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus2020-04-08 发布2020-05-15 实施江苏省市场监督管理局发 布DB32/T 37752020I目目次次前言.1 范围.12 规范性引用文件.13 缩略语.14 原理.15 试剂和仪器设备.26 操作程序.27 结果判定.48 安全和防污染措施.4附录A（规范性附录）试剂的配制.5附录B（资料性附录）.6DB32/T 37752020II前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由南京农业大学提出并归口。本标准起草单位：南京农业大学。本标准主要起草人：姜平、张日腾、白娟、熊富强、王先炜、李玉峰、陈闻。DB32/T 377520201猪繁殖与呼吸综合征病毒 RT-LAMP 检测方法1范围本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测原理、试剂和仪器设备、检测程序和结果判定。本标准适用于猪临床样品（肺脏、脾脏和血清）和细胞培养物中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测；同时适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒经典型、高致病性、类NADC30型三种基因亚型的分型检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本文件。GB 19489实验室生物安全通用要求GB/T 27401实验室质量控制规范动物检疫。NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范SN/T1193基因检验实验室技术要求3缩略语PRRSV:porcine reproductive and respiratory syndrome virus，猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP：loop-mediated isothermal amplification,环介导的恒温扩增RT-LAMP：Reverse transcription,loop-mediated isothermal amplification，反转录环介导的恒温扩增。4原理猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）主要引起猪繁殖与呼吸综合征(俗称蓝耳病)。该病毒有美洲型和欧洲型两个血清型。美洲型又有多个基因亚型。我国流行的美洲型 PRRSV 主要有传统型、高致病性和类 NADC30 型毒株，其主要区别存在于病毒的 Nsp2 基因。环介导的恒温扩增（LAMP）是一种体外恒温核酸扩增技术，用于快速检测 DNA。RT-LAMP 是一种逆转录 LAMP，用于检测 RNA。本标准RT-LAMP，根据 PRRSV 开放阅读框架 7（ORF7）基因序列、ORF1a（非结构蛋白 Nsp2）基因序列设计 4 组引物，建立 4 种 RT-LAMP 检测方法（即 LAMP1、LAMP2、LAMP3 和 LAMP4)，其中 LAMP1的特异性引物识别 ORF7 基因，LAMP2、LAMP3 和 LAMP4 的特异性引物识别 Nsp2 基因。每种 LAMP引物均包括两对内、外引物（内引物 FIP 与 BIP，外引物 F3 与 B3）和一对环引物（LF 与 LB）。利用Bst 酶启动循环链置换反应，启动互补链合成，通过在同一链上互补序列周而复始形成有很多环状结构的茎环 DNA 混合物，在恒温条件下完成核酸扩增反应。从 dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。该检测方法简便快速、敏感特异，不需要昂贵的仪器设备。DB32/T 3775202025试剂和仪器设备5.1试剂要求除有特殊说明外，所有生化试剂均为分析纯。RNA提取相关试剂或用品均需经无RNA酶处理。5.2引物PRRSV LAMP检测引物和PRRSV毒株基因亚型鉴别LAMP引物，人工合成（基因序列见附录B.1）。5.3通用试剂裂解液（TRIZOL）；氯仿；0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）（见附录A.1）；DEPC处理水（见附录A.2）；异丙醇；75%乙醇；耐热M-MLV（RNase H-）反转录酶；pMD18-T载体；胶回收试剂盒（Qiagen）；质粒DNA提取试剂盒（TaKaRa）；PCR试剂（Promega）。5.4LAMP 试剂10Bst DNA 聚合酶缓冲液（见附录 A.3）；100 mmol/L MgSO4；10 mmol/L dNTPs（dATP,dCTP,dTTP,dGTP)；8 U/L Bst DNA 聚合酶；5 mol/L 甜菜碱（Betaine）；灭菌双蒸水。SYBR Green I 染料，1000。5.5阴性及阳性对照5.5.1阴性对照pMD18-T空载体质粒。5.5.2阳性对照LAMP1阳性对照为pMD-BB-N质粒（含高致病性PRRSV BB0907毒株ORF7基因）；LAMP2阳性对照为pMD-S1-Nsp2质粒（含传统型PRRSV S1毒株Nsp2基因）；LAMP3阳性对照为pMD-BB-Nsp2质粒（含高致病性PRRSV BB0907毒株Nsp2基因）；LAMP4阳性对照为pMD-FJ-Nsp2 质粒（含类NADC30 PRRSVFJ1402毒株Nsp2基因）。5.6仪器高速冷冻离心机，恒温水浴锅，微量移液器（0.5 L10 L、20 L200 L、100 L1 000 L），PCR 仪，EP 反应管（0.5 mL、1.5 mL），组织匀浆器或研钵。6检测程序6.1样品处理按照NY/T 541动物疫病实验室检验采样方法，采集待检猪的肺脏、脾脏和血清等样品。肺脏、脾脏取约1g，剪碎后按1:3（V/V）加入PBS（0.01mol/L，pH7.2），充分匀浆呈悬液。血清制备方法为：血DB32/T 377520203液（不加抗凝剂）室温静置2 h 3 h后，4000 r/min离心5 min，取上清液置于EP管内。处理好的匀浆悬液和血清于-20 保存备用。样品 RNA 制备按照经验证的 RNA 提取方法或等效的商品化 RNA 提取试剂盒，按照其使用说明操作。提取的 RNA 应在 2 h 内进行反转录或放置于-20保存备用。6.2反转录（cDNA 的合成）配制反转录反应体系 19 L，含 M-MLV 5Reaction buffer（含 Mg2+）4 L；2.5 mol/L dNTPs 1 L；Olige（dT）1L，RNA 酶抑制剂 0.5 L；DEPC ddH2O 5.5L,RNA 7 L，70水浴 5 min 后置冰上冷却至 37，再加入 1.0 L 反转录酶 M-MLV，42水浴 1h 得 cDNA，用于下面 LAMP 扩增，或-20冻存备用。6.3LAMP 检测方法6.3.1反应体系采用四管两步RT-LAMP检测方法进行。第一步（1管）：采用LAMP1通用引物（见附录B.1），检测所有PRRSV 毒株。第二步（3管）：对第一步检测结果为阳性的样本，采用LAMP2、LAMP3和LAMP4引物（见附录B.1），用3个EP管，同时进行LAMP，鉴别不同基因亚型PRRSV。四个反应管反应体系相同，总体积25 L，具体反应体系如下：但其中的引物不同，分别是LAMP1、LAMP2、LAMP3和LAMP4引物（见附录B.1）。每次检测应分别设立阴性和阳性对照样品管。LAMP1阳性对照为pMD-BB-N，LAMP2阳性对照为pMD-S1-Nsp2，LAMP3阳性对照为pMD-BB-Nsp2，LAMP4阳性对照为pMD-FJ-Nsp2质粒DNA，阴性对照为pMD18-T空载体质粒DNA。在 EP 管的管盖上滴加 1000SYBR Green 染料 1.0 L，再轻轻地把盖子盖紧。6.3.2反应条件将反应管混匀，置 641扩增 40 min 且保证管盖上的 SYBR Green I 不进入反应物。10Bst DNA 聚合酶缓冲液（见附录 A.3）MgSO4（4mol/L）2.5mM dNTPs甜菜碱（Betaine）外引物 F3/B3（4mol/L）内引物 FIP/BIP（40mol/L）环引物 LF/LB（10mol/L）Bst DNA 聚合酶(8U)耐热 M-MLV 反转录酶cDNA 模板双蒸水2.5L1.5L3.5L2.0L各 1.0L各 1.0L各 1.0L1.0L1.0L1.5L6.0L总计25LDB32/T 3775202047结果判定7.1PRRSV 阴阳性判定反应结束后，将LAMP1反应管12 000 r/min，离心1 min，轻轻混匀，观察颜色变化，绿色为阳性，淡黄色为阴性。7.2PRRSV 基因亚型的类型判定在阴性对照、阳性对照符合时，判定样品检测结果（参见附录 B.2）。若 LAMP1 结果为阳性，则判定是 PRRSV 阳性，否则判定为 PRRSV 阴性。若 LAMP2 检测为阳性，LAMP3、LAMP4 检测为阴性，则判定是 PRRSV 经典型毒株。若 LAMP3 检测为阳性，LAMP2、LAMP4 检测为阴性，则判定是 PRRSV 高致病性毒株。若 LAMP4 检测为阳性，LAMP2、LAMP3 检测为阴性，则判定是 PRRSV 类 NADC30 型毒株。8安全和防污染措施8.1检测废弃物等实验室安全防护按 GB 19489 和 SN/T 1193 的规定执行。8.2检测过程中防止污染措施按 GB/T 27401 的规定执行。8.3实验前后，实验室用紫外线消毒。DB32/T 377520205AA附录 A（规范性附录）试剂配制A.10.01 mol/L（pH7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）A 液（0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO42H2O 27.6 g，先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至 1000 mL。B 液（0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO412H2O 71.6 g（或 Na2HPO4 2H2O 35.6 g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至 1000 mL。A 液 14 mL，B 液 36 mL，加氯化钠（NaCl）8.5 g，最后用蒸馏水定容至 1 000 mL；121，15 min高压灭菌，4 保存备用。A.2DEPC 处理水用 0.1%DEPC 处理后的蒸馏水（DEPC 与蒸馏水 1:1000 混合），经 121 15 min 高压处理，用于溶解 RNA。A.310Bst DNA 聚合酶缓冲液含200 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，100 mmol/L(NH4)2SO4，20 mmol/L MgSO4，1%Triton-100，pH8.8，25保存。DB32/T 377520206BB附录B（资料性附录）引物序列B1PRRSV LAMP 检测引物和 PRRSV 毒株基因亚型鉴别 LAMP 引物序列，见表 B.1。表 B.1 LAMP 引物序列引物种类引物名称序列bp通用引物LAMP1G-F3AGAAAAACCCGGAGAAGCC140-156G-B3TGCTGAGGGTGATGCTGT352-369G-FIPACAATTGCCGCTCACTAGGGGTTTTCCATTTCCCTCTTGCGACT157-177203-223G-BIPCGCTGGAACTTGTGCCCTGTTTTTGCACAGTATGTTGCGTAGGC258-277318-337G-LFGTGATGCCTGACGTCATCTTC178-198G-LBGGGAGGATAAGTTACACTGTGGA286-308BB-NFATGCCAATAATAACGGCAAGCA0-22RTCATGCTGAGGGTGATGCTGT351-371经典毒株LAMP2C-F3ACCGCAATGCATCTTCAGG1523-1546C-B3GTCTGT