DB32T 1457-2009 猪圆环病毒2型检测方法 SYBR Green I实时定量PCR.pdf

DB32/T1457-2009前言为规范猪圆环病毒2型检测SYBRGreenI实时定量PCR法，提高猪圆环病毒2型检测的灵敏度、特异性、检测效率，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则、GB/T1.2-2002标准化工作导则第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法进行编制。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农科院兽医研究所。本标准起草人：潘群兴、温立斌、郭容利、倪艳秀、张雪寒、周俊明、吕立新、何孔旺。DB32/T1457-200902.5 L,110 L,10100 L,20200 L,1001000 L,并配备与移液器匹配的吸头。4.2.6高压灭菌锅5采样和样品前处理5.1样品的采集采集病死猪（包括流产的死胎）和扑杀猪的淋巴结组织，于04冷藏保存并立即送检，采样过程中样品不得交叉污染。5.2样品的处理淋巴结组织剪碎后研制成糊状，按1：3用PBS缓冲液悬浮收集于离心管内，以6000g离心5min,取上清夜待检。6DNA抽提取上清液465L,加入25L10%十二烷基硫酸钠和10L的20mg/mL蛋白酶K,42水浴摇床上放置1h;加入等量的饱和酚溶液500uL,振荡混匀20s,12000g离心5min,取上清液；加入等量的酚：氯仿：异戊醇（体积比25：24：1），振荡混匀20s,12000g离心10min;加入两倍体积的无水乙醇及1/10体积3mol/L乙酸钠，上下颠倒混匀，-20沉淀2h;12000g离心10min,弃上清，室温干燥后，加入30L双蒸水溶解沉淀，即得DNA模板，-20C保存备用。PCV2阳性对照样品和阴性对照样品与待检样品同步进行处理，并进行DNA抽提。另外，DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提试剂盒进行。7荧光PCR检测7.1PCR检测体系及条件PCR反应中各组分用量：10倍Taq酶反应缓冲液2.5L、dNTP0.5L、Taq聚合酶0.5L、DNA模板2 L、上下游引物各0.5 L、SYBR Green I染料1 L、双蒸水17.5L,总体系25L。PCV2阳性和阴性样品的检测体系同样配制。混匀后，置荧光定量PCR仪扩增40次。首先95C变性2min;再95/30s,56.3/30s,72C/30s进行40个循环，75时收集荧光信号。7.2荧光定量PCR分析7.2.1扩增曲线分析阳性对照出现典型的S型扩增曲线，模板浓度越高，Ct值越小。阴性对照在35个循环后出现扩增现象，熔解曲线分析是引物二聚体的形成导致荧光信号值增强。7.2.2熔解曲线分析目的产物熔解温度为82.40.12。8结果判定及描述PCV2阳性对照出现典型的S型扩增曲线，且Ct值35，阴性对照Ct值35时实验成立。若检测样品的Ct值35，则判定猪圆环病毒2型核酸阴性。若检测样品的Ct值30，出现典型的S型扩增曲线，判定猪圆环病毒2型核酸阳性。若检测样品的30Ct值35，或虽然Ct值30但扩增曲线不显著，则建议对样品进行复检。