DB45T 1681-2018 活禽批发市场禽流感监测技术规范.pdf

ICS 11.220 B 41 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 1681-2018 活禽批发市场禽流感监测技术规范 Technical specification for avian influenza surveillance in live poultry wholesale markets 2018-03-25 发布 2018-04-25 实施广西壮族自治区质量技术监督局 发 布 DB45/T 16812018 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 信息收集.3 5 样品采集.3 6 样品实验室检测.5 7 检测结果处理.5 附录 A（规范性附录）溶液配置.7 附录 B（资料性附录）采样数量.8 附录 C（资料性附录）抽样数量.10 附录 D（资料性附录）禽流感采样记录.12 DB45/T 16812018 II DB45/T 16812018 III 前 言 本标准按照GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出。本标准并广西畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：邹联斌、施开创、莫胜兰、屈素洁、尹彦文、张步娴、粟艳琼、李军。DB45/T 16812018 1 活禽批发市场禽流感监测技术规范 1 范围 本标准规定了活禽批发市场中禽流感样品的信息收集、样品采集、实验室检测、检测结果处理等。本标准适用于广西境内活禽批发市场中禽流感的紧急监测和日常监测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18635 动物防疫基本术语 GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术 NY 764 高致病性禽流感疫情判定和扑灭技术规范 NY/T 765 高致病性禽流感样品采集、保存及运输技术规范 NY/T 770 高致病性禽流感监测技术规范 NY/T 771 高致病性禽流感流行病学调查技术规范 NY/T 772 禽流感病毒RT-PCR检测方法 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 国办函200551号 国家突发重大动物疫情应急预案 国办发200412 号 全国高致病性禽流感应急预案 农牧发199918号 动物疫情报告管理办法 农医发201313号 农业部关于印发和转发的通知 农医发201422号 农业部关于印发的通知 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 活禽批发市场 live birds wholesale market 从事活的鸡、鸭、鹅及其他禽类批发交易的市场。3.2 禽流感 avian influenza AI 正粘病毒科流感病毒属 A 型流感病毒引起的禽类传染性疾病。DB45/T 16812018 2 3.3 监测 surveillance 对某种疫病的发生、流行、分布及相关因素进行系统的长时间的观察与检测，以把握该疫病的发生情况和发展趋势。3.4 流行病学单元 epidemiology unit 具有明确的流行病学关系、暴露于某一病原的可能性大体相同的动物或动物群，如处于同一环境（如同一个活禽批发市场、同一个摊位）或饲养管理方式相同的动物。流行病学单元可以是单个动物个体，也可以是动物群。流行病学单元在流行病学抽样调查和监测中，又称为抽样单元。3.5 群体 population 处于同一环境内、相同生产阶段或相同生物安全管理措施下，面临相同感染风险的同一种动物或流行病学单元的总体。3.6 样本 sample 目标群的一部分，由按照一定程序从目标群中抽取的那部分个体或抽样单元组成。3.7 抽样 sampling 又称取样，从一个研究的群体中选出一部分个体，作为整个群体的代表。3.8 简单随机抽样 simple random sampling 从总体 N 个单位中任意抽取 n 个单位作为样本，使每个可能的样本被抽中的概率相等的抽样方式。3.9 两阶段抽样 two-stage sampling 对区域面积大且样本单元复杂或不清楚的动物疫病抽样调查所采取的抽样技术。第一步抽取流行病学单元；第二步从流行病学单元内抽取个体动物。3.10 主观抽样 purposive sampling 又称目的抽样，研究者依据自己的专业知识和经验，以及对调查群体的了解，有意识的选择某些研究对象。3.11 便利抽样 convenience sampling 研究者根据实际情况，为方便开展工作，仅选择那些离得最近的、最容易得到的群体或个体作为调查对象。DB45/T 16812018 3 3.12 靶向抽样 targeted sampling 根据一个或多个特征对目标群进行分层，这些特征通常被认为是与疾病发生概率有联系的。靶向抽样可能包含的样本仅是从发现疾病概率最高的层次得到的。3.13 分层随机抽样 stratified random sampling 又称类型随机抽样，将总体各单位按一定标准分成各种类型（或层）；然后根据各类型单位数与总体单位数的比例，确定从各类型中抽取样本单位的数量；最后，按照随机原则从各类型中抽取样本。3.14 置信水平 level of confidence 所实施的监测能够从某一假定存在感染的群体中检出感染的概率。3.15 预期流行率 expected prevalance rate 预计某个特定时间，某特定区域规定动物疫病病例数或发病数与动物群体个体总数的平均值之比。可分为群间预期流行率和群内预期流行率。4 信息收集 4.1 活禽批发市场的信息包括名称、地址、地理位置、摊位数、家禽种类、家禽来源、日成交量、主要销往地等。4.2 样品的信息包括样品编号、种类、数量、摊位号、摊主姓名、联系方式、家禽种类、来源、群体数量等。5 样品采集 5.1 采样前准备 5.1.1 器具和试剂 5.1.1.1 采样器材 冷藏保温箱、酒精棉、一次性注射器、2 mL离心管、离心管盒、灭菌医用棉签（塑料杆棉签为宜）、冰袋、不干胶标签、签字笔、记号笔、采样登记表等。5.1.1.2 保存液 在2 mL的离心管中加入1 mL1.5 mL的样品保存液，-20 保存备用。制备方法见附录 A中的A.2。5.1.1.3 人员防护用品 口罩、一次性手套、防护服、防护帽、水鞋等。DB45/T 16812018 4 5.2 采集 5.2.1 样品种类 血清样品、咽喉/泄殖腔拭子、环境样品。5.2.2 样品数量 活禽批发市场的监测根据监测目的的不同常采取两种或两种以上的方法混合进行抽样。计算样本量时，常使用95%的置信水平。5.2.3 抽样方式 5.2.3.1 分层+两阶段抽样法 在经费、人员和时间较充足，并且对该活禽批发市场的背景比较清楚的情况下，宜用此法。抽样方法为：a)按照一定的分类方法，将批发市场里的家禽分层。例如分为鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑等层次，或分为鸡、水禽、特禽等三层；b)在各层里按简单随机抽样法选取流行病学单元(摊位),选取的摊位数参照附录 B 中的表 B.1；c)在摊位里随机抽取禽只，禽只数量参照附录 C 中的表 C.1。5.2.3.2 分层抽样+便利抽样 按设定好了每个活禽批发市场的采样数量和每个摊位的采样数量采样。抽样方法为：a)分层抽样，按照一定的方法，将批发市场里的家禽分层。再按一定的方法，最简单的是按比例（例如每层内的摊位数与市场内总摊位数的比例）,确定每层抽取的摊位数；b)采取便利抽样法在各层里选择流行病学单元(摊位)。例如选择主人愿意配合或者证明材料较为齐全的摊位；c)按照设定的抽样数量，在摊位里按便利抽样法抽取禽只采样。5.2.3.3 靶向抽样+主观抽样 此法适用于紧急监测、无疫证明和发现疫病。抽样方法为：靶向抽样法，按照禽流感的流行病学特点、疫情信息等，选择来自疫区或高发区、易感或感染率高的禽群；主观抽样法，在每个摊位按照自己的经验和想法抽取一定数量和种类的样品。每个摊位采 20个粪便/笼具拭子、5 个不同取样点的水样、20 个家禽咽喉/泄殖腔拭子和 5 个血样。5.2.4 样品采集方法 5.2.4.1 血清样品采集 采用翅静脉采血，每只禽采取血样1.5 mL2 mL，经离心或自然放置析出血清后，将血清移到离心管，盖紧封好口，贴好标签。血清与棉拭子须一一对应，并填写采样单。5.2.4.2 咽喉/泄殖腔拭子采集 将采集的咽喉/泄殖腔拭子放入同一个样品保存液的离心管或分开装，采集方法为：取咽喉拭子时要确保将拭子深入喉头口及上颚来回刮 35 次取咽喉分泌液；DB45/T 16812018 5 取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔约 1.5 cm2.0 cm 转一圈并沾取少量粪便。5.2.4.3 环境样品采集 以擦拭涂抹的方式重点采集市场摊位的食槽、饮水槽、地面、下水池、家禽及鸟类粪便、笼具表面或用具表面等环境样品。采样时采样拭子不得与禽类接触。5.2.5 样品信息收集 样品信息参见附录D中的表D.1，采取查看禽群，询问市场管理人员和摊主、查验运输登记记录和产地检疫合格证明等方式收集样品信息。采样单应用签字笔逐项填写，样品标签和离心管应用防水记号笔做标记。5.3 样品保存和运输 5.3.1 样品应置于冷藏保温箱中保存，保温容器应密封，防止渗漏。5.3.2 样品运输时，如能在 24 h 内送到实验室，可用冰袋冷藏运输。如果超过 24 h，应作冷冻处理，再用冰袋冷藏运输。5.3.3 样品到达实验室后，如不能立即检测，应冷冻（以-20 或以下为宜）保存。避免反复冻融。6 样品实验室检测 6.1 实验器材及试剂 应符合 GB/T 18936 和 NY/T 772 的规定。6.2 血清样品检测 血凝抑制试验（HI），按照 GB/T 18936 的要求操作。根据监测目的,选择不同亚型的禽流感抗原。6.3 拭子样品检测 检测按照 NY/T 772 的要求操作，先用禽流感通用引物检测，结果为阳性时，再进行鉴定。6.4 判定标准 6.4.1 血清抗体阳性，按照 GB/T 18936 的要求，通过血凝抑制试验（HI）检测，抗体效价5 log2，结果判定为阳性。6.4.2 禽流感病毒核酸阳，结果按照 NY/T 772 的要求判定。7 检测结果处理 7.1 血清学检测结果阳性 7.1.1 已经免疫过某亚型禽流感疫苗的，血清抗体阳性，用作免疫效果评估。7.1.2 没有免疫过禽流感疫苗的，血清抗体阳性，提示曾经感染过某亚型禽流感，属高致病性禽流感，应按农医发201313 号、农医发201422 号的要求进行处理。DB45/T 16812018 6 7.2 病原学检测阳性 7.2.1 低致病性禽流感，可根据监测目的进行流行病学调查。7.2.2 高致病性禽流感、国家需根除和控制的低致病性禽流感，应按照国办发200412 号和 NY 764的要求进行处置。7.3 监测结果由各级动物疫病预防控制机构存档或备案。7.4 动物疫病预防控制机构应定期对监测结果进行分析、汇总和报告。DB45/T 16812018 7 A A 附 录 A（规范性附录）溶液配置 A.1 PBS配制 将试剂按次序加入定量器中,加适量蒸馏水溶解后,再定容至1 000 mL,调pH至7.4,高压消毒灭菌112 kPa 20 min，冷却后，保存于4 冰箱中备用。PBS配制试剂见表A.1。表A.1 PBS 配制试剂 试剂 用量（g）NaCl 8.0 KH2PO4 0.2 Na2HPO412H2O 2.9 KCl 0.2 A.2 样品保存液 将抗生素溶解到500 mLPBS溶液中，并调pH值至7.2，加入终浓度为10%的甘油或终浓为5%的小牛血清。将配制好的保存液分装到2 mL的离心管中，每管1 mL1.5 mL，-20 保存备用。样品保存液配制见表A.2。表A.2 样品保存液配制 试剂 用量 青霉素（80 万单位/0.48 g）2.6 g 链霉素（100 万单位/1 g）5.0 g 庆大霉素（