DB43T 2327-2022 羊肚菌菌种质量检验规程.pdf

Regulations for quality inspection of morchella strains羊肚菌菌种质量检验规程发 布湖南省市场监督管理局2022-05发布-0643湖南省地方标准ICSCCS 67.080B 31DB43/T 23272022 2022-08实施-06DB43/T 23272022 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 抽样 1 5 感官检验 1 6 杂菌及害虫检验 1 7 菌种鉴定 2 8 菌种活力检验 2 9 栽培检验 3 10 判定规则 3 11 档案管理 4 附录 A（资料性）羊肚菌基因组 DNA 提取方法 5 附录 B（资料性）PCR 扩增体系和扩增程序 6 附录 C（资料性）羊肚菌菌种质量检验档案 7 DB43/T 23272022 II DB43/T 23272022 III 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：湖南省微生物研究院、湖南湘蕈生物科技有限公司、湖南双红农科生态工程有限公司。本文件主要起草人：许隽、喻桃生、雷潇、邵晨霞、唐少军、贺月林、靳磊、吴胜莲、杨祎、任锐、孙志光、何晓林。DB43/T 23272022 IV DB43/T 23272022 1 羊肚菌菌种质量检验规程 1 范围 本文件规定了羊肚菌菌种质量检验的术语和定义、抽样、感观检验、杂菌及害虫检验、菌种鉴定、菌种活力检验、栽培检验、判定规则、档案管理等技术要求。本文件适用于羊肚菌母种、原种和栽培种（以下简称“菌种”）的质量检验。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 12728 食用菌术语 GB/T 30989 高通量基因测序技术规程 NY/T 1284 食用菌菌种中杂菌及害虫的检验 NY/T 1846 食用菌菌种检验规程 DB43/T 1908 羊肚菌简易拱棚栽培技术规程 3 术语和定义 GB/T 12728 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 羊肚菌 morchella spp.隶属子囊菌门（Ascomycota）、盘菌纲（Discomycetes）、盘菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌属（Morchella），因其外表凹陷状似羊肚而得名。4 抽样 菌种的抽样应符合 NY/T 1846 的规定。5 感官检验 样品的感官检验应符合 NY/T 1846 的规定。6 杂菌及害虫检验 样品的杂菌及害虫检验应符合 NY/T 1284 的规定。DB43/T 23272022 2 7 菌种鉴定 7.1 菌丝体培养 将活化的羊肚菌菌块接种于液体土豆培养基，20 静置培养 7 d10 d，然后收集菌丝体，用无菌水反复清洗干净，再用灭菌滤纸吸干水分，直接使用或-20 保存。7.2 基因组 DNA 提取 基因组 DNA 的提取方法参见附录 A，得到的 DNA 浓度不宜低于 50 ng/l，1.7A260/A2802.0。7.3 PCR 扩增 选择 ITS 通用引物 ITS1/ITS4：TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR 扩增体系和扩增程序参见附录 B。7.4 电泳检测 采用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，用凝胶成像系统拍照并记录电泳条带，黑色羊肚菌类群（包括梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌等）条带应为 800 bp，条带大小正确且无其他杂带的样品应进行双向测序，测序方法应符合 GB/T 30989 的规定。7.5 数据库比对 获得的测序结果应在 NCBI 数据库进行 Blastn 比对（https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/），或者在RDP 数据库进行 Classifier 比对（http:/rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp），初步分析测序菌种的分类地位。7.6 系统发育树的构建 下载准确的的羊肚菌 ITS 序列，利用软件 CLUSTAL 进行多序列比对，用软件 MEGA 通过最大简约法(maximum parsimony,MP)和邻位相连法(neighbour joining,NJ)分别构建分子系统发育树，初步确定测序菌种的分类地位。适宜生产的菌种分类地位应为梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌等。8 菌种活力检验 8.1 平板继代培养 在含 PDA 固体培养基的培养皿中央接种初始菌种的菌块，20避光培养 2 d3 d，当菌丝生长至距离培养皿边缘约 1 cm 处时，用打孔器取菌丝前端直径 0.5 cm 的圆形菌块，转接至新的 PDA 培养皿中继代培养。8.2 菌种萌发检验 菌块应在继代培养 6 h10 h 后萌发。8.3 菌丝生长速率检验 采用十字交叉法分别在继代培养 1 d、2 d、3 d 时测量羊肚菌菌落直径，计算菌丝生长速率，羊肚DB43/T 23272022 3 菌菌丝平均生长速率应大于 10 mm/d。8.4 菌丝长势检验 菌丝应均匀，菌落边缘应整齐。8.5 菌丝微观形态检验 继代培养 2 d3 d 后，使用体视显微镜观察主菌丝和二级菌丝分枝的夹角，夹角应小于 30。8.6 菌核检验 继代培养 5 d10 d 后，菌落上应产生白色颗粒，培养 14 d 后白色颗粒应变成黄棕色菌核；无菌核产生的菌种不宜用于生产。8.7 菌落颜色检验 继代培养 10 d15 d 后，菌落应无色素或色素较浅；色素产生多的菌种不宜用于生产。9 栽培检验 9.1 试验场地 宜选择温湿度、光照、通风等可控的菇房或人工气候培养箱。9.2 栽培方式 宜采用塑料筐覆土或床架覆土方式进行小量栽培试验，每个菌种栽培面积应不少于 3 m2，至少有 3个随机小区重复，栽培管理参见 DB43/T 1908。9.3 菌种萌发检验 播种 1 d3 d 菌种应萌发。9.4 分生孢子检验 播种 5 d10 d 菌丝应在土壤中迅速扩延，应产生适量的菌霜（分生孢子）。9.5 外源营养袋检验 施加外源营养袋 20 d30 d，营养袋应充满羊肚菌菌丝。9.6 羊肚菌原基检验 土壤表面应产生大量原基，原基应有分化为幼菇的趋势。10 判定规则 菌种的感官检验、杂菌及害虫检验、菌种鉴定、菌种活力检验、栽培检验均符合要求的为合格菌种。DB43/T 23272022 4 11 档案管理 应建立羊肚菌菌种检验档案，档案内容应包括但不限于感官检验、杂菌及害虫检验、菌种鉴定、菌种活力检验、栽培检验等内容，档案应保存 3 年以上。DB43/T 23272022 5 附 录 A（资料性）羊肚菌基因组 DNA 提取方法 羊肚菌基因组 DNA 提取按照以下步骤进行：a）将菌丝体加入液氮研磨成粉末，取约 0.1 g 粉末转移至无菌的 2 ml 离心管中；b）加入 700 l 裂解液（CTAB 2，pH=8.0）65 裂解 1.52.0 h，每隔 10 min 颠倒混匀；c）12000 r/min 离心 10 min，取上清液转移至新的离心管；d）加入等体积的 PCA（苯酚:氯仿:异戊醇=25241），缓慢混匀；e）12000 r/min 离心 10 min，取上清液加入等体积 CA（氯仿:异戊醇=241），缓慢混匀；f）12000 r/min 离心 10 min，取上清液加入 2 倍体积的无水乙醇，缓慢混匀，置20 静置 1 h以上；g）12000 r/min 离心 10 min 弃上清留下 DNA 沉淀；h）用 1 mL 75乙醇清洗 DNA 沉淀，离心弃上清；i）用含 1 RNase A 的 TE 缓冲液（Tris-HCl 10 mmol/L,EDTA 1 mmol/L）或灭菌双蒸水溶解沉淀；j）采用超微量分光光度计或琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 浓度和质量。DB43/T 23272022 6 附 录 B（资料性）PCR 扩增体系和扩增程序 B.1 PCR 扩增体系 PCR 扩增的总体积为 50 l，其中 10PCR Buffer 5 l，dNTPs 5l，引物 ITS1/ITS4 各 1 l，Taq聚合酶 0.5 l，模板 DNA 2 l，双蒸水 35.5 l。B.2 PCR 扩增程序 首先 94 预变性 5 min；然后 94 变性 30 sec，55 退火 30 sec，72 延伸 60 sec，30 个循环；最后 72 延伸 7 min。DB43/T 23272022 7 附 录 C（资料性）羊肚菌菌种质量检验档案 表 1 羊肚菌菌种质量检验档案表 菌种名称 菌种来源 菌种级别 接种日期 保藏条件 联系人 菌种质量检验步骤 感官检验 气味 瓶塞（盖）松紧度 菌种颜色 干燥度 记录人 杂菌及害虫 检验 斑点 液体培养检验 液体培养检验 镜检 记录人 菌种鉴定 DNA 浓度 电泳结果 测序结果 进化树分析 记录人 菌种活力检验 菌种萌发 菌丝生长速率 菌丝长势 菌丝微观形态 菌落颜色 菌核 记录人 栽培检验 菌种萌发 分生孢子 原基数量/m2 记录人 判定结果 是否合格 记录人