DB42T 788-2012 猪流感病毒（H1亚型）酶联免疫吸附试验抗体检测方法.pdf

ICS11.220B 41备案号：DB42湖北省地方标准DB42/T 7882012猪流感病毒(H1 亚型)酶联免疫吸附试验抗体检测方法Method of the Enzyme-linked immunosobent assay for the detection of antibodiesagainst swine influenza virus(subtype H1)2012-01-06 发布2012-03-01 实施湖北省质量技术监督局发 布DB42/T 7882012I目次前言.II引言.III1范围.12缩略词.13实验原理.14实验条件.15实验材料.16实验方法.27结果判定.38注意事项.3附录 A.4DB42/T 7882012II前言本标准按 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由华中农业大学提出。本标准由湖北省农业厅归口。本标准起草单位：华中农业大学动物医学院、武汉科前动物生物制品有限责任公司、湖北省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：金梅林、郭学波、杨影、陈焕春、徐高原、钟广汉、宋念华、田峰、董晓辉、孙小美、李淑云。DB42/T 7882012III引言猪流感病毒(Swine Influenza Virus,SIV)属正粘病毒科，可引起猪流行性感冒(Swine Influenza,SI)。在猪群中广泛流行的 SIV 主要是古典型 H1N1 和类禽型 H1N1，可引起猪咳嗽、呼吸困难、发热和衰竭等症状易暴发流行。由于 SIV 对呼吸道上皮的高度特异亲嗜性而使呼吸道管壁上皮受损，导致猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌等细菌和猪呼吸道冠状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的继发或混合感染，使病情更为复杂。为开展猪流感的免疫监测，了解猪群猪流感病毒抗体水平，指导猪流感免疫预防工作，特制定本标准。DB42/T 78820121猪流感病毒(H1 亚型)酶联免疫吸附试验抗体检测方法1范围本标准规定了猪流感病毒(H1 亚型)酶联免疫吸附试验抗体检测方法的缩略词、实验原理、实验条件、实验材料、实验方法、结果判定和注意事项等。本标准适用于猪血清中的流感病毒抗体的检测。2缩略词下列缩略词适用于本文件。ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）：酶联免疫吸附试验OD630nm值：630 纳米波长处的吸光值HRP：辣根过氧化物酶HI 法：血凝抑制试验法S：样品孔 OD630nm值P：阳性对照孔 OD630nm平均值3实验原理应用酶联免疫原理制成检测猪流感病毒（H1 亚型）抗体的间接 ELISA 方法。利用抗原抗体反应的特异性，将特异性的猪流感病毒（H1 亚型）抗原吸附到固相载体的表面后，待检物中若含有相应的抗体，则可与所包被的抗原相结合，并能进一步和酶标记抗体结合形成复合物。在遇到相应的底物时，复合物中的酶能催化底物发生显色反应。其显色的深浅与相应的抗体量成正相关，可借助 OD630nm值的大小进行定性判断。4实验条件4.1实验室实验操作宜在常温（18 25）进行。4.2仪器台式低温高速离心机、微量移液器、冰箱、恒温箱、酶标仪。4.3人员注意个人防护和环境保护。5实验材料DB42/T 788201225.1猪流感病毒（H1 亚型）抗原（见附录 A.8）。5.2酶标板：96 孔板，可拆。5.3酶标记抗体（见附录 A.9）。5.4阳性对照血清（见附录 A.10）。5.5阴性对照血清（见附录 A.11）。5.6其它试剂包被液、封闭液、洗涤液、样品稀释液、底物液 A、底物液 B、终止液。试剂配方及要求见附录A。6实验方法6.1样品采集将采集的猪全血静置 30 min，收集上清备用。6.2抗原包被板制备取猪流感病毒（H1 亚型）抗原用包被液稀释到工作浓度（2.5 g/mL），加入酶标板，100 L/孔，37 孵育 2 h。弃去孔中液体，拍干。加入封闭液，200 L/孔，于 37 封闭 2 h，取出酶标板弃去孔中液体在吸水纸上拍干，于 2 8 保存，可保存 7 d。6.3样品稀释在血清稀释板中按 1:40 的比例稀释样品（例如：195 L 样品稀释液中加入 5 L 样品，即为 1:40稀释）。稀释好的样品可在 2 8 保存 7 d。6.4加样取出抗原包被板（根据样品多少，可拆开分次使用），先用洗涤液洗板 1 次，再将稀释好的样品取加入抗原包被板，100 L/孔。同时设 2 孔阴性对照、2 孔阳性对照及 1 孔空白对照，轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置 37 下孵育 30 min。6.5洗涤取出抗原包被板弃去孔中液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗板 3 次，200 L/孔。每次静置 3 min后倒掉液体，在吸水纸上拍干。6.6加酶标记抗体取酶标记抗体用样品稀释液稀释到工作浓度，加入酶标板，100 L/孔，37 孵育 30 min。按 6.5中方法洗板 3 次。6.7加底物液每孔加底物液 A 和底物液 B 各 50 L，混匀，置室温下（18 25）避光显色 10 min。6.8加终止液每孔加终止液 50 L，轻轻振荡混匀。6.9测定结果DB42/T 78820123以空白对照孔调零，用酶标仪测定各孔的 OD630nm值。测定结果必须在加入终止液后 10 min 内完成。7结果判定7.1试验成立的条件是两个阳性对照孔的 OD630nm值相差应0.3；两个阳性对照孔 OD630nm值均应0.8，且1.6。两个阴性对照孔 OD630nm值均应0.2。7.2如果 S0.3，判为阳性；如果 S0.3，则判为阴性。8注意事项实验过程中注意做好个人的生物安全防护措施，废弃物应做无害化处理。DB42/T 78820124AA附录A（规范性附录）试剂的配制A.1包被液的配制碳酸钠（Na2CO3）1.59 g碳酸氢钠（NaHCO3）2.93 g加蒸馏水或去离子水定容至 1000 mL 即可，置 2 8 下保存。A.2封闭液的配制5 g 牛血清白蛋白（BSA）溶于 1000 mL 洗涤液。置 2 8 下保存。A.3洗涤液的配制氯化钠（NaCl）8 g氯化钾（KCl）0.2 g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）2.9 g磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2 gTween-200.5 mL加蒸馏水或去离子水定容至 1000 mL 即可。置 2 8 下保存。A.4样品稀释液的配制牛血清白蛋白（BSA）5.0 g二甲基亚砜（DMSO）10 mL加洗涤定容至 1000 mL。置 2 8 下保存。A.5底物液A的配制磷酸氢二钠（Na2HPO4）14.6 g柠檬酸（C6H8O7）9.33 g过氧化脲（CH6N2O3）0.52 g加蒸馏水至1000 mL用盐酸调pH值至5.05.4，置2 8 下保存。A.6底物液B的配制四甲基联苯胺（TMB）20 mg无水乙醇（C2H6O）10 mLDB42/T 78820125加蒸馏水至1000 mL置2 8 下避光保存。A.7终止液的配制40%的氢氟酸(HF)625 L加蒸馏水至100 mL置2 8 下保存。A.8猪流感病毒（H1 亚型）抗原猪流感病毒（H1 亚型）抗原由基因工程技术表达获得。-20 下保存备用。A.9酶标记抗体酶标记抗体由羊抗猪 I gG 经 HRP 标记获得。2 8 下保存备用。A.10阳性对照血清通过筛选猪流感病毒（H1 亚型）抗体阳性猪获得，效价应大于 7l og2（HI 法）。2 8 下保存备用。A.11阴性对照血清通过筛选猪流感病毒（H1 亚型）抗体阴性猪获得，效价应小于 2l og2（HI 法）。2 8 下保存备用。_