DB41T 1728-2018 饲料添加剂丁酸梭菌的测定 微生物法.pdf

ICS 65.120 B 20 DB41 河南省地方标准 DB 41/T 17282018 饲料添加剂丁酸梭菌的测定 微生物法 2018-11-26 发布 2019-02-26 实施 河南省质量技术监督局 发 布 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17282018 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位:河南海瑞正检测技术有限公司、河南省兽药饲料监察所、河南省种牛遗传性能测定中心。本标准主要起草人:朱慧慧、陆静、方忠意、李灵平、周永亮、黄好强、麻晓燕、王洋洋、范晓燕、魏金销。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17282018 1 饲料添加剂丁酸梭菌的测定 微生物法 1 范围 本标准规定了饲料添加剂丁酸梭菌的检测方法 微生物法。本标准适用于饲料及饲料添加剂中丁酸梭菌的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 3 培养基或材料 3.1 亚硫酸铁琼脂培养基:见附录 A 中 A.1。3.2 0.85%生理盐水:见附录 A 中 A.2。3.3 产酸指示培养基:见附录 B 中 B.1。3.4 明胶培养基。3.5 淀粉水解培养基。3.6 革兰氏染色配套试剂:见附录 A 中 A.3。3.7 胰蛋白胨大豆琼脂(TSW)。注：除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。水应符合GB/T 6682中三级水的要求。4 仪器设备 4.1 天平:感量 0.01 g。4.2 粉碎机。4.3 高压灭菌器。4.4 恒温培养箱。4.5 电热鼓风干燥箱。4.6 拍击式匀质器。4.7 厌氧罐（配厌氧产气袋）。4.8 超净工作台。4.9 移液器:100 L1 000 L。4.10 显微镜。4.11 酒精灯。4.12 试管架。4.13 灭菌试管:15 mL。4.14 灭菌平皿:直径 90 mm。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17282018 2 5 测定步骤 5.1 试样稀释及培养 5.1.1 无菌条件下称取试样 25 g(mL)样品，加入装有 225 mL 0.85%灭菌生理盐水的匀质袋中，然后用匀质器拍打 2 min3 min，制成 1:10 的均匀稀释液。5.1.2 用移液器移取 1:10 稀释液 1 mL，注入含有 9 mL 0.85%灭菌生理盐水的试管中，充分混匀后，制成 1:100 的稀释液。5.1.3 按上述操作方法，10 倍递增稀释，如此每递增稀释一次。5.1.4 选择 23 个适宜稀释度，用移液器移取 1 mL 稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿，同时用 1 mL 无菌生理盐水作对照。然后将凉至 50 左右的培养基注入平皿中，小心转动培养基使试样与培养基充分混匀。5.1.5 待培养基凝固后迅速将平皿倒置于培养箱中，37 厌氧培养 18 h24 h，观察菌落形态。5.2 菌落特征 亚硫酸铁琼脂培养基上，菌落圆形，较小、规则、实心，刚开始为黑色，放置 1 d2 d 时间黑色褪为白色。5.3 确证试验 从平皿中选出 5 个特征菌落进行确证试验，在胰蛋白胨大豆琼脂平皿上进行纯化。挑选纯化的菌落做革兰氏染色和生化试验，生化试验项目如表 1。确证结果:革兰氏染色为阳性菌，菌体呈杆状，能形成圆形或椭圆形芽孢，菌体中部膨大呈梭形。生化试验不水解明胶，水解淀粉，可以利用蜜二糖和葡萄糖产酸，不利用松三糖，鼠李糖和山梨醇，即可判定为丁酸梭菌。表1 生化鉴定 项目 明胶液化 淀粉水解 蜜二糖 松三糖 鼠李糖 山梨糖 葡萄糖 结果-+-+注：-:阴性；+:阳性 6 结果计算与报告 6.1 计算每块平板上的丁酸梭菌菌落数 a，使用式（1）计算:CAba（1）式中:a-计算每块平板上的丁酸梭菌菌落数；b-挑选后经证实为丁酸梭菌的菌落数；A-挑选平板上用于验证的菌落数；C-平板上的所有特征菌落数。最终结果按照 GB/T 8170 数值修约规则修约至整数。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17282018 3 6.2 样品中丁酸梭菌数的计算方法与报告 选择两个连续稀释度平板（每个稀释度至少有一块平板），其上经确证后的丁酸梭菌数介于 30300之间，通过式（2）计算，即为 1 mL 或 1 g 样品中的丁酸梭菌菌数 N:dnnaN)1.0(21 （2）式中:N 样品中丁酸梭菌菌数；a 所有平板经确证后的丁酸梭菌菌数的总和；n1 第一个稀释的平均数；n2 第二个稀释的平均数；d 第一个稀释度的稀释因子（未经稀释的液体样品的 d 值为 1）。按照 GB/T 8170 数值修约规则将计算出的结果保留两位有效数字，也可将样品的丁酸梭菌菌落数记录为 1.09.9 乘以 10 的指数幂表示。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17282018 4 附 录 A（资料性附录）培养基和试剂 A.1 硫酸亚铁培养基 A.1.1 成分 胰蛋白胨 15.0 g 大豆蛋白胨 5.0 g 酵母粉 5.0 g 偏重亚硫酸钠 1.0 g 柠檬酸铁铵 1.0 g 琼脂 20.0 g 蒸馏水 1 000 mL A.1.2 制法 将上述成分置于烧杯中加热溶解，分装于三角瓶中；121 高压灭菌 15 min。A.2 0.85%生理盐水 称取氯化钠（分析纯）8.5 g，溶于 1 000 mL蒸馏瓶中。分装于三角瓶中，121 高压灭菌 15 min。A.3 革兰氏染色 A.3.1 结晶紫染色液 A.3.1.1 成分 结晶紫 1.0 g 95%乙醇 20 mL 1%草酸氨溶液 80 mL A.3.1.2 制法 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.3.2 革兰氏碘液 A.3.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.3.2.2 制法 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300 mL。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17282018 5 A.3.3 沙黄复染液 A.3.3.1 成分 沙黄 0.25 g 95%乙醇 10 mL 蒸馏水 90 mL A.3.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中，用蒸馏水稀释。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17282018 6 附 录 B（规范性附录）培养基和试剂 B.1 产酸指示培养基 B.1.1 成分 磷酸氢二铵 1.0 g 氯化钾 0.2 g 硫酸镁 0.2 g 酵母膏 0.2 g 0.04%溴甲酚紫 15 mL 琼脂 5.0 g 蒸馏水 1 000 mL B.1.2 制法 除溴甲酚紫外，其余成分溶解于水，加入所需用糖，必要时可加热溶解，调节 pH 至 7.0 左右，加入指示剂溴甲酚紫，分装于试管，115 高压灭菌 30 min。试验方法:挑取培物接种于上述培养基中，36 培养 2 d5 d，观察指示剂变黄，表示产酸，为阳性；不变或变蓝，为阴性。_ 河南省地方标准公共服务平台