DB44T 665-2009 蛋中喹诺酮类药物的多残留检测方法.pdf

ICS 67.050 B 04 备案号：25947-2009 广东省地方标准DB44/T 6652009蛋中喹诺酮类药物的多残留检测方法 Multiresidue determination of quinolone antibiotics in egg 2009-08-06 发布 2009-12-01 实施DB44广东省质量技术监督局广东省质量技术监督局 发布 发布 DB44/T 6652009 I 前 言 本标准附录A和附录B为资料性附录。本标准由广东省农业厅提出并归口。本标准起草单位：国家兽药残留基准实验室（华南农业大学）。本标准主要起草人：黄显会、曾振灵、杨桂香、饶勇、董爱国、刘志昌、陈杖榴。本标准为国内首次发布的广东省地方标准。DB44/T 6652009 1 蛋中喹诺酮类药物的多残留检测方法 1 范围 本标准规定了鸡蛋中喹诺酮类药物残留检测的高效液相色谱（HPLC）和液相色谱串联质谱(LC-MS-MS)测定方法，规定LC-MS-MS法为仲裁法。本标准适用于鸡蛋中恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、氟甲喹和噁喹酸单个或多个药物的残留的HPLC法定量测定。本标准还适用于鸡蛋中恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、麻保沙星、氟甲喹、萘啶酸和噁喹酸单个或多个药物残留的LC-MS-MS法定量测定和确证。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 3 试样的制备与保存 3.1 试样的制备 取新鲜或冷藏的鸡蛋35枚，去蛋壳，以10 000 r/min匀浆5 min，装入洁净的容器中，密封。空白鸡蛋，作为空白试样；添加适宜浓度的标准溶液的空白鸡蛋，作为空白加标试样；供试样品，作为供试试样。3.2 试样的保存 试样应在-20以下保存。4 HPLC 法 4.1 原理 鸡蛋样品中喹诺酮类药物以乙腈-三氯乙酸提取，反相聚合物SPE柱净化。以柠檬酸乙酸铵-乙腈为流动相，梯度洗脱程序波长高效液相-荧光法测定，外标法定量。4.2 试剂 以下所有试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。4.2.1 乙腈：色谱纯。4.2.2 甲醇：色谱纯。4.2.3 柠檬酸。4.2.4 乙酸铵。4.2.5 三乙胺。4.2.6 磷酸氢二钠。4.2.7 磷酸二氢钠。4.2.8 乙酸。4.2.9 氢氧化钠。4.2.10 三氯乙酸。DB44/T 6652009 2 4.2.11 乙酸溶液：10%取 10 mL，用水稀释定容至 100 mL。4.2.12 氢氧化钠溶液：0.5 mol/L 称取氢氧化钠 2.0 g，用水溶解，稀释定容至 100 mL。4.2.13 三氯乙酸溶液：10%称取三氯乙酸 100 g 溶于 1 000 mL 水中。4.2.14 乙腈-10%三氯乙酸溶液(2080，V/V)。4.2.15 磷酸盐缓冲液：0.05 mol/L（pH7.4）。称取NaH2PO4 2H2O 7.25 g和Na2HPO4 12H2O 0.74 g，用水溶解，稀释定容至 1 L。4.2.16 甲醇水溶液：10%（V/V）。4.2.17 柠檬酸/乙酸铵缓冲液 称取柠檬酸 10.56 g 和乙酸铵 7.87 g，用水溶解，稀释定容至 1 L，加三乙胺约 1 mL 调 pH 至 4.0，0.45m 滤膜抽滤。4.2.18 乙腈柠檬酸/乙酸铵缓冲液（892，V/V）。4.2.19 喹诺酮类药物对照品：恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、氟甲喹和噁喹酸，各药物纯度均大于 98.0%4.2.20 11 种喹诺酮类药物标准储备液 4.2.20.1 诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟沙星标准储备液：1.0 mg/mL。取上述药物的对照品，准确称定，用乙酸溶液200 L溶解，用甲醇稀释定容至10.0 mL，分别制成1.0 mg/mL的喹诺酮类药物标准贮备溶液。4.2.20.2 环丙沙星、洛美沙星、培氟沙星和达氟沙星标准储备液：1.0 mg/mL。取盐酸环丙沙星、盐酸洛美沙星、甲磺酸培氟沙星和甲磺酸达氟沙星的对照品，准确称定，用水200 L溶解，用甲醇稀释定容至10.0 mL，分别制成1.0 mg/mL的喹诺酮类药物标准贮备溶液。4.2.20.3 噁喹酸和氟甲喹标准储备液：1.0 mg/mL。取上述药物的对照品，准确称定，用氢氧化钠溶液400 L溶解，用甲醇稀释定容至10 mL，分别制成1.0 mg/mL的喹诺酮类药物标准贮备溶液。4.2.21 11 种喹诺酮类药物混合标准中间溶液：此混合标准中间溶液中含诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、氟甲喹和噁喹酸的浓度为 8 g/mL，含达氟沙星的浓度为 3.2 g/mL。分别准确量取适量的每种喹诺酮类药物标准贮备溶液，用甲醇稀释成上述含量的 11 种喹诺酮类药物混合标准中间溶液。4.3 仪器设备 4.3.1 高效液相色谱仪：配荧光检测器，可以进行二元梯度洗脱。4.3.2 分析天平：感量 0.0001 g。4.3.3 电子天平：感量 0.01 g。4.3.4 组织匀浆机。4.3.5 旋涡混合仪。4.3.6 超声波水浴。4.3.7 高速冷冻离心机，配 1.5 mL、15 mL 转头。4.3.8 氮气吹干浓缩仪。4.3.9 可调微量移液器：10100 L、20200 L、1001 000 L、5005 000 L。4.3.10 负压固相萃取装置：配备真空泵。4.3.11 反相聚合物 SPE 柱：Strata-X 填料，60 mg/3 mL，或相当者。4.3.12 保护柱：C18。4.4 测定步骤 DB44/T 6652009 3 4.4.1 提取 取试样，室温解冻，称取（2.00.02）g，置匀浆杯中，加磷酸盐缓冲液4.0 mL，旋涡混合30 s。加乙腈-10%三氯乙酸溶液10 mL，以10 000 r/min匀浆3 min，转移至50mL离心管中；另用乙腈-10%三氯乙酸溶液5 mL洗刀头和匀浆杯，合并样液，旋涡混合30 s；超声5 min；在4条件下，以8000 r/min离心6 min；取全部上清液置试管中，用磷酸盐缓冲液10 mL稀释后备用。4.4.2 SPE 净化 将反相聚合物SPE柱以3 mL甲醇活化,3 mL 水平衡；加入上述用磷酸盐缓冲液稀释后的提取液，保持流速约为1 mL/min；甲醇水溶液3 mL淋洗，抽干；甲醇3 mL洗脱，抽干。洗脱液于6070氮气吹干，用乙腈柠檬酸/乙酸铵缓冲液1 000 L溶解残留物，涡旋混匀，在4条件下，12 000 r/min离心6 min，上清液转移至样品瓶中供高效液相色谱仪测定。4.4.3 标准曲线的制备 称取(2.00.01)g空白鸡蛋试样，加11种喹诺酮类药物系列混合标准中间溶液适量，制得的空白加标试样含达氟沙星的量为5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160 g/kg，含其他喹诺酮类药物为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 g/kg。按4.4.1进行样品提取和4.4.2净化和按4.4.4条件进行HPLC测定。将样品的色谱峰面积和相对应的药物质量浓度进行线性回归，得到各个药物的校正标准曲线。4.4.4 测定 4.4.4.1 色谱条件 色谱柱：C18（250 mm4.6 mm，粒径5 m）。或其他效果等同的C18柱。保护柱：C18（4.0 mm3.0 mm）。或其他效果等同的C18柱。流动相：乙腈+柠檬酸/乙酸铵缓冲液，梯度洗脱见表1。柱温：50。进样量：40 L。荧光检测器：程序波长变化设置见表2。波长变换的时间在二氟沙星完全出峰之后和噁喹酸尚未出峰之前的保留时间，若分离系统的保留时间发生了改变，则此时间参数也要进行相应的调整，本标准所提供的波长变换时间仅供参考。表1 梯度洗脱流动相变化设置 时间(min)流量(mL/min)乙腈，%柠檬酸/乙酸铵缓冲液，%曲线 0 2.0 9 91 6 11.00 2.0 9 91 6 20.00 2.0 29 71 6 25.00 2.0 35 45 6 26.00 2.0 9 91 6 30.00 2.0 9 91 6 表2 荧光程序波长变化设置 时间(min)激发波长 Ex(nm)发射波长 Em(nm)0 278 465 17.5 312 366 DB44/T 6652009 4 4.4.4.2 测定法 根据试样溶液中喹诺酮类药物残留量情况，进行标准曲线或单点校准。进行单点校正时，应选定峰面积相近的标准工作溶液进行单点校正。4.4.5 空白试验 除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。4.4.6 结果计算和表述 4.4.6.1 标准曲线校准 将标准曲线的浓度和对应峰面积进行回归分析，然后按式（1）计算。abAX（1）式中：X供试鸡蛋中喹诺酮类药物的残留量，g/kg；A供试鸡蛋中喹诺酮药物处理后试样溶液中被测喹诺酮类药物的色谱峰面积；b标准曲线回归方程中截距；a标准曲线回归方程中斜率。4.4.6.2 单点校准 按式（2）计算供试鸡蛋中喹诺酮药物残留量：10001000mVAACXsiSi（2）式中：Xi供试鸡蛋中喹诺酮类药物的残留量，g/kg；Cs基质匹配标准溶液中对应喹诺酮类药物的浓度，ng/mL；Ai试样溶液中被测喹诺酮类药物的色谱峰面积；As基质标准溶液中对应喹诺酮类药物的色谱峰面积；m试样溶液所代表的供试鸡蛋样品的质量，g；V样品终定容的体积，mL。4.5 检测方法灵敏度、准确度、精密度 4.5.1 灵敏度 本方法在鸡蛋中11种喹诺酮类药物的检测限分别是：诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹均为12.5 g/kg，达氟沙星在5 g/kg。本方法在鸡蛋中11种喹诺酮类药物的定量限分别是：诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹均为25 g/kg，达氟沙星在10 g/kg。4.5.2 准确度 本方法在鸡蛋中，诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹在25、50、100 g/kg以及达氟沙星在10、20、40 g/kg三个添加水平上的回收率在60.0%100.0%。4.5.3 精密度 本方法在鸡蛋中，诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹在25、50、100 g/kg以及达氟沙星在10、20、40 g/kg三个添加水平上的批内变异系数CV15.0%，批间变异系数CV20.0%。5 LC-MS-MS 法（仲裁法）5.1 原理 DB44/T 6652009 5 蛋样品中喹诺酮类药物以冰乙酸-乙醇提取，反相聚合物SPE柱净化，用液相色谱-串联质谱ESI正离子模式进行定性和定量测定。5.2 试剂与材料 以下所有试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。5.2.1 乙腈 色谱纯。5.2.2 甲醇 色谱纯。5.2.3 甲酸 色谱纯。5.2.4 乙酸。5.2.5 氢氧化钠。5.2.6 三氯乙酸。5.2.7 乙酸溶液：10%取乙酸 10 mL，用水稀释定容至 100 mL。5.2.8 氢氧化钠溶液：0.5 mol/L 称取氢氧化钠 2.0 g，用水溶解，稀释定容至 100 mL。5.2.9 三氯乙酸溶液：20%称取三氯乙酸 20 g 溶于 1 00 mL 水中。5.2.10 乙酸乙醇溶液（199，V/V）。5.2.11 甲醇水溶液：1