DB42T 1582-2020 饲料中牛、羊源性成分定性PCR检测方法.pdf

ICS65.120CCS B 46湖北省地方标准DB42/T 1582202042饲料中牛、羊源性成分定性 PCR 检测方法Detection of bovine,ovine,caprine derived materials in feedstuffs by qualitativepolymerase chain reaction(PCR)method2020-07-07 发布2020-11-07 实施湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局发 布FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1582 FORMTEXT 2020I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14原理.15试剂和材料.16仪器和设备.27分析步骤.38结果分析.59结果判定与表述.510PCR 产物测序结果判定与表述.511检测过程中防止交叉污染的措施.512废弃物处理.5附录 A（资料性）扩增产物序列（来源 NCBI）.6FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1582 FORMTEXT 2020II前言本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由华中农业大学提出。本文件由湖北省农业农村厅归口。本文件起草单位：华中农业大学、湖北省畜禽产品质量监督检验测试中心。本文件主要起草人：刘榜，王文君，刘祖红，金秀娥，付明，周翔，梁昱，王峻。本文件实施中的疑问可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-87665821，邮箱：；华中农业大学，联系电话：027-87382290，邮箱：。对本文件的有关修改意见及建议请华中农业大学，联系电话：027-87282038，邮箱：。FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1582 FORMTEXT 20201饲料中牛、羊源性成分定性 PCR 检测方法1范围本文件规定了饲料中除乳制品以外的牛（普通牛、瘤牛、牦牛和水牛）、羊（绵羊和山羊）源性成分的定性PCR检测方法。本文件适用于饲料中除乳制品以外的牛（普通牛、瘤牛、牦牛和水牛）、羊（绵羊和山羊）源性成分的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1 饲料 采样GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理根据牛、羊特异性序列，设计一对特异性引物，对待检样品提取的DNA进行PCR扩增，依据扩增特异性片段的结果，判断待检样品中是否含有牛或羊源性成分，并可根据片段大小差异进而判断是牛源性成分（125 bp），还是羊源性成分（107 bp）。5试剂和材料5.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。5.2琼脂糖。5.3GelRed 核酸染料。注：根据需要可选择其他效果相当的核酸染料作为核酸电泳的染色剂。5.410 mol/L 氢氧化钠溶液：在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠（NaOH），溶解后冷却至室温，再加水定容至 200 mL。FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1582 FORMTEXT 202025.50.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）：称取 18.6 g 乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入 70 mL 水中，再加入适量氢氧化钠溶液（5.4），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（5.4）调 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。5.61 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）：称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于 800 mL 水中，用盐酸（HCl）调 pH 至 8.0，加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。5.75 mol/L 氯化钠溶液：称取 29.22 g 氯化钠（NaCl）溶于 80 mL 水中，加水定容至 100 mL。在 103.4kPa 蒸汽压（121）条件下灭菌 20 min。5.810%十二烷基磺酸钠溶液：称取 10 g 十二烷基磺酸钠（C12H25SO4Na，SDS），加入 80 mL 水中，加热至完全溶解后，冷却至室温，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa 蒸汽压（121）条件下灭菌 20 min。5.9DNA 提取细胞裂解液：量取 200 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（5.5），200 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.6），40 mL 氯化钠溶液（5.7），200 mL 十二烷基磺酸钠溶液（5.8），混合后用水定容至 1 000 mL，室温保存，备用。5.1020 mg/mL 蛋白酶 K 溶液：将 200 mg 蛋白酶 K（Proteinase K）溶于 9.5mL 水中，轻摇至完全溶解后，加水定容至 10 mL。于-20 保存备用。5.11硼酸。5.12Tris-饱和酚。5.13氯仿：异戊醇(24:1)：将氯仿和异戊醇按照 24:1 的比例配制。5.14无水乙醇。5.1575%乙醇。5.16TE 缓冲液（pH 8.0）：分别量取 10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.6）和 2 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（5.5）溶液，加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。5.175TBE 缓冲液：称取 54 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），加入 27.5 g 硼酸，先用 500 mL 水加热搅拌溶解后，加入 20 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（5.5），用 10mol/L 氢氧化钠溶液（5.4）调 pH 至8.0，然后加水定容到 1 000 mL。使用时用水稀释成 0.5TBE。5.18Taq 酶。5.1910PCR 缓冲液。5.20dNTP 混合液。5.216DNA 上样缓冲液。5.22DNA 分子量标记：可清楚的区分 100bp1 000bp 的 DNA 片段。5.23物种特异性引物（表 1）。5.24引物溶液：用 TE 缓冲液（5.16）或水分别将引物稀释到 10mol/L。5.25PCR 产物回收试剂盒。表 1引物信息引物名称引物序列片段大小/bp上游引物a5-ATGGCTTAGGACCCAGCTCT-3牛 125、羊 107下游引物b5-ACARa)CCAGAACCTGGATCGGA-3aR=A/G,简并碱基。6仪器和设备FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1582 FORMTEXT 202036.1分析天平：感量不小于 0.1mg。6.2PCR 扩增仪：升降温速度1.5/s，孔间温度差异1.0。6.3电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.4紫外透射仪。6.5紫外分光光度计。6.6凝胶成像系统或照相系统。6.7微量可调移液器：0.1 L2.5 L，1 L10 L，10 L100 L，100 L1 000 L。6.8涡旋振荡器。6.9离心机（最大离心力12 000g）。6.10恒温水浴锅。7分析步骤7.1样品采集与制备按照GB/T 14699.1采样，粉碎并充分混合均匀后，-20 保存备用。7.2DNA 模板制备7.2.1试样 DNA 提取试样 DNA 提取步骤如下：a)样品颗粒 100 目时最少称取 0.05 g，60 目时最少称取 0.1 g，20 目时最少称取 0.2 g；b)称取样品于 2 mL 离心管中，加入 1 mL 细胞裂解液（5.9），然后加入 30 L 蛋白酶 K（5.10）溶液，混匀，56 消化 6 h10 h 至无明显组织块，4，12 000g离心 10 min，取上清移至新的 2 mL 离心管中；c)加入等体积的 Tris-饱和酚（5.12），缓慢颠倒混匀 10 min，4，12 000g离心 10 min，取上清液移至新的 2 mL 离心管中；d)加入 0.5 倍体积的 Tris-饱和酚（5.12）和 0.5 倍体积的氯仿：异戊醇（24:1）（5.13），缓慢颠倒混匀 10 min，4，12 000g离心 10 min；e)取上清液移至新的 2 mL 离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）（5.13），缓慢颠倒混匀 10 min，4，12 000g离心 5 min；f)多次重复操作步骤 e)，直到两相中间不能看到明显的变性蛋白质为止，取上清液移至新的 4 mL离心管中；g)加入 2 倍体积-20 预冷的无水乙醇（5.14），轻轻摇晃至絮状沉淀析出，12 000g离心 5 min10 min，倒掉上清液；h)加入 1 mL 75%乙醇（5.15）洗涤沉淀，12 000g离心 3 min，吸去上清液，重复 1 次2 次；i)室温下放置使残余乙醇完全挥发，加入 30 L50 L TE 缓冲液（5.16）溶解 DNA 沉淀，-20 保存 DNA 溶液。7.2.2DNA 质量评估使用紫外分光光度计对试样DNA的质量进行评估，检测260 nm和280 nm处的吸光值A260和A280，满足以下要求则适宜进行PCR扩增：a)DNA 浓度为 50 ng/L1 000 ng/L；b)A260/A280 比值应在 1.82.0 之间。FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1582 FORMTEXT 202047.3PCR 反应7.3.1试样 PCR 反应7.3.1.1每个试样 PCR 反应设置 3 个平行。7.3.1.2在 PCR 反应管中按表 2 依次加入反应试剂，混匀。也可采用经验证的、等效的定性 PCR 反应试剂盒配制反应体系。7.3.1.3将 PCR 管放入离心机中，2 000g离心 1 min，取出 PCR 管后，放入 PCR 仪中。7.3.1.4进行 PCR 反应。反应程序为：95预变性 5min；95变性 30s，62退火 30s，72延伸 15s，共进行 35 次循环；72延伸 3min；4 降温 2 min。7.3.1.5反应结束后取出 PCR 管，对 PCR 反应产物进行电泳检测。表 2PCR 检测反应体系试剂用量/L终浓度双蒸水13.510Buffer21dNTPs 混合液（各 2.5 mmol/L）1.6各 0.2 mmol/L5 U/L Taq 酶0.10.025 U/L10 mol/L 上游引物0.40.2 mol/L10 mol/L 下游引物0.40.2 mol/L25 ng/L DNA 模板2.02.5 ng/L总体积20.0注：若采用定性PCR试剂盒，则按试剂盒说明书的推荐用量配制反应体系，但正向引物和反向引物用量按表2执行。7.3.2对照 PCR 反应在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。分别以牛和羊的基因组DNA作为阳性对照；以除上述目标物种以外的常见动物的基因组DNA作为阴性对照；以水作为空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件与试样PCR（7.3.1）相同。7.4PCR 产物电泳检测称量琼脂糖（5.2）适量，加入0.5TBE缓冲液（5.17）至终浓度为25 g/L，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加入5L GelRed核酸染料（5.3），混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入含0.5TBE缓冲液（5.17）电泳槽中，垂直向上轻轻拔去梳板。取5 L PCR 产物与 1 L 6DNA 上样缓冲液（5.21），混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标记（5.22），接通电源，在2