DB42T 1589-2020 H7亚型禽流感病毒竞争 ELSIA抗体检测方法.pdf

ICS 65.020.30CCS B 41DB42湖北省地方标准DB 42/T 15892020H7 亚型禽流感病毒竞争 ELISA 抗体检测方法Competitive ELISA for detection of antibodies against H7 subtype avian influenzavirus2020-07-07 发布2020-11-07 实施湖北省市场监督管理局发 布DB42/T XXXXX2020I目次前言.II引言.III1范围.12规范性引用文件.13术语与定义.14检测原理.15检测条件.16操作步骤.27结果判定.2附录 A（资料性附录）酶标抗体的制备.4附录 B（资料性附录）对照品的制备.7附录 C（规范性附录）试剂配制.8附录 D（资料性附录）样品处理注意事项.9DB42/T XXXXX2020II前言本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则给出的规则起草。本文件由华中农业大学提出。本文件由湖北省农业农村厅归口管理。本文件起草单位：华中农业大学、武汉科前生物股份有限公司。本文件主要起草人：金梅林、范俊青、李冉、董俊、王园园、但汉并、吴超、董晓辉、徐高原。本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-87665821，邮箱：；华中农业大学，联系电话：027-87282038，邮箱：。对本文件的有关修改意见建议请反馈至华中农业大学，电话：027-87286905，邮箱：。DB42/T XXXXX2020III引言禽流感（avian influenza,AI）是由甲型流感病毒感染引起的禽类急性传染病。按照致病力的强弱可分为无致病性禽流感、低致病性禽流感、中致病性禽流感和高致病性禽流感。禽流感病毒H7亚型属于高致病性禽流感，OIE将高致病性禽流感列为必须上报的传染病，我国将其列为是优先防治和重点防范的人兽共患病。目前，检测H7亚型禽流感病毒抗体的经典方法是血凝抑制（HI）试验，该方法的优点是对试验条件要求低，缺点是：操作繁琐，实验结果重复性差，灵敏度低，凝集情况的准确判断需要大量观察后总结经验，受主观影响因素较大。H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测方法是用纯化的病毒作为包被抗原，包被酶标板，同时加入待检血清和抗HA蛋白单克隆抗体的酶标记物，使血清中的抗体与单抗竞争包被板上的抗原表位，从而判断血清中是否含有H7亚型禽流感病毒抗体的一种方法，是一种操作简便、检出率高、敏感性高、特异性强的方法，且能实现高通量检测和标准化，结果更客观，判定方便、直观、快速准确。DB42/T XXXXX20201H7 亚型禽流感病毒竞争 ELISA 抗体检测方法1范围本文件规定了H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测的术语与定义、检测原理、检测条件、操作步骤、结果判定。本文件适用于H7亚型禽流感病毒抗体的检测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1辣根过氧化物酶 HRP（horseradish peroxidase,HRP）通常来源于辣根，因此称辣根过氧化物酶，是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类(ELISA)试剂盒。4检测原理本文件采用竞争酶联免疫吸附法（cELISA）的原理，待检血清中的抗体和酶标抗体竞争与固相抗原结合，如检血清中抗体含量越多，则与固相抗原结合的酶标抗体就越少，经底物催化后显色越浅。将H7亚型禽流感病毒血凝抑制试验抗原吸附到固相载体的表面形成固相抗原，待检血清和酶标抗体同时加入包被板，若待检血清中含有抗体，则可与抗原相结合，同时酶标抗体也抗原的结合量减少；加入底物后，底物被酶标抗体中的HRP催化成为有色产物，产物的量与待检血清中抗体的量呈负相关，故可根据呈色的深浅进行定性分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使检测方法具有良好的敏感性。5检测条件5.1仪器与耗材级生物安全柜或者超净工作台、酶标仪（配制450nm波长滤光片）、离心机（4000r/min）、微量可调移液器（200L、1 mL）、枪头（200L、1mL）、恒温箱（37）、电子天平（0.01g-300g）、聚苯乙烯微量反应板（96孔）、离心管（1.5mL、2mL、5mL）。5.2试剂DB42/T XXXXX20202HRP标的记H7亚型禽流感病毒单克隆抗体、H7亚型禽流感病毒血凝抑制试验抗原、底物液、终止液、包被液、封闭液、20倍浓缩洗涤液、样品稀释液、阴性对照品、阳性对照品。H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备、纯化及HRP标记方法见附录A。阴性对照品、阳性对照品的制备方法见附录B。试剂配制方法见附录C。6操作步骤6.1样品处理取动物全血，待血液充分凝固后，4000r/min离心10min，收集上清。要求血清清亮，无溶血。样品处理过程中应防止样品的污染，注意个人安全防护，具体注意事项见附录D。6.2抗原包被板的制备6.2.1包被用包被液将H7亚型禽流感病毒血凝抑制试验抗原稀释至工作浓度（0.2g/mL）加至酶标板孔中，每孔100L，在28放置15h。6.2.2封闭弃去包被液，每孔加入封闭液200L，置37孵育2h；弃去封闭液，拍干，再置37干燥2h。6.3洗涤液的配制使用前，将20倍浓缩洗涤液恢复至室温（22-25）并摇动使沉淀溶解，按照50mL 20倍浓缩洗涤液加入950mL去离子水的比例稀释，稀释好的洗涤液在2-8保存，有效期为7日。6.4洗涤弃去孔中液体，每孔加入配制好的洗涤液200L，弃去孔中液体。洗涤4次，最后一次在吸水纸上拍干。6.5待检血清的稀释待检血清在血清稀释板中按10倍稀释。例如10L血清加入到90L样品稀释液中，混匀备用。6.6加入待检样品和酶标记物取制备好的抗原包被板，用配制的洗涤液洗涤抗原包被板1次，将稀释好的待检血清、阴性对照和阳性对照各取50L加至抗原包被板中，待检血清各设1孔，阴、阳性对照各设2孔，同时加入酶标记物50L。轻轻振匀孔中样品，置37下温育45min。洗涤4次，最后一次在吸水纸上拍干。6.7显色和终止反应每孔加入底物液100L，置2025下避光显色15min。每孔加终止液50L。10min内在酶标仪上测定450nm波长处的吸光度（OD值）。7结果判定DB42/T XXXXX202037.1试验成立条件阴性对照的平均OD450nm值1.0，阳性对照的抑制率（PI值）50%。7.2结果计算PI值按式（1）确定：%1001NSPI值（1）式中：PI样品的抑制率；S样品孔OD450nm值；N阴性对照孔平均OD450nm值。7.3结果判定被检样品的PI值40%，该样品判为阴性；被检样品的PI值40%，该样品判为阳性。DB42/T XXXXX20204AA附录A（资料性）酶标抗体的制备A.1H7 亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备A.1.1免疫原在禽流感病毒 H7 亚型血凝抑制试验抗原中加入 pH 值 7.4 的 PBS 2mL 溶解，重悬后的溶液加入等体积饱和硫酸铵搅匀，置 28作用 15h 后，28 8000r/min 离心 40min，收集沉淀物加入原病毒液 1/20 体积的生理盐水溶解，装透析袋内，用 PBS 透析 15h 除盐。测定浓缩抗原液的蛋白含量，加入终浓度为 0.04硫柳汞钠，并调整病毒液的蛋白浓度至 20.05 mg/mL，同时用 HA 试验检测该病毒液的效价，当其 HA 效价28 即可作为免疫原。A.1.2小鼠免疫首次免疫取免疫原与弗氏完全佐剂按照体积 1:1 进行乳化，68 周龄雌性 BALB/c 小鼠 3 只，皮下分点注射 200g/只，每个点约注射 20g。以后每间隔 2 周免疫一次，第二、三次免疫将免疫原与弗氏不完全佐剂乳化，皮下分点注射 100g/只。第三次免疫后一周后，自小鼠尾静脉采血用ELISA 法检测血清抗体效价，选择效价高的小鼠在融合前 3 天腹腔注射抗原（不含佐剂）约 200g 进行加强免疫。A.1.3骨髓瘤细胞的培养融合前一周复苏 SP2/0 骨髓瘤细胞，培养在含 20%胎牛血清的 RPMI1640 培养基中。选择处于对数生长期的 SP2/0，以 RPMI1640 培养基洗涤两次后，用约 10mL RPMI1640 培养基将其吹下。收集于 50mL 离心管，1000r/min 离心 5min，弃上清液，轻轻敲打管底使细胞松散，加入 10mLRPMI1640 培养基重悬细胞。将细胞悬液 10 倍稀释后计数，准备融合。A.1.4免疫脾细胞的制备取加强免疫 4 天后的小鼠，摘取眼球眼眶放血，获得阳性血清，脱颈处死，置于 75%的酒精中浸泡 10min，无菌取出脾脏，先用 RPMI1640 培养基洗涤数次，去除附着的结缔组织；再将脾脏移入另一置有 300 目微孔滤网的新鲜 RPMI1640 培养基中，眼科剪刀剪开一个小口，用研磨棒轻轻挤压，释放脾细胞，制成脾细胞悬液，移至 10mL 离心管中，置 37，含 5%二氧化碳的培养箱内自然沉降 10min，吸取上层细胞悬液于 50 mL 离心管中，再加入 3mL RPMI1640 培养基重复洗涤 2 次。以1000r/min 离心 10min，弃上清液。加入 10mL RPMI1640 培养基重悬细胞。将细胞悬液 10 倍稀释后计数。A.1.5饲养细胞的制备取空白 BALB/c 小鼠一只，摘取眼球眼眶放血，获得阴性血清，脱颈处死，置于75%的酒精中浸泡 10min，无菌取出脾脏，先用 RPMI1640 培养基洗涤 2 次，去除附着的结缔组织；再将脾脏移入另一置有 200 目微孔滤网的 RPMI1640 培养基中，眼科剪刀剪开一个小口，用研磨棒轻轻挤压，释放脾细胞，制成脾细胞悬液，移至 10mL 离心管中，置 37，含 5%二氧化碳的培养箱内自然沉降 10min，吸取上层细胞悬液于 50mL 离心管中，再加入 3mL RPMI1640 培养基重复洗涤 2 次。以 1000r/min 离心10min，弃上清液。加入 10 mL RPMI1640 培养基重悬细胞。A.1.6细胞融合将一瓶含 20%胎牛血清、1%HAT 的 RPMI1640 培养基、1mL 50%PEG1450、放入 37温箱中预热。将重悬后的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞在 50 mL 离心管中混匀，1000r/min 离心 10min，弃去上清液，用滤纸将管壁上残留的液体吸干，用手指尖轻轻弹管底，使两种细胞充分混匀，将离心管置于37水浴中；吸取预热的 PEG 溶液 0.8mL，向细胞沉淀缓缓滴加，边滴边轻轻搅拌，在 1min 内加完。静置 30 秒，之后 3min 内加入预热的 RPMI1640 培养基 3mL，终止 PEG 的作用。余下的 17mL 培养基在 2min内加完。融合完成后，1000r/min 离心 10min，弃上清液。将沉淀的细胞轻轻悬浮于 20%胎牛血清、1%HAT的 RPMI1640 培养基中，加入适量的饲养细胞后，置于 96 孔细胞培养板中，约 200L/孔，置 37，含5%二氧化碳的培养箱内培养。第五天补加 1 滴 HAT 培养基，第 8 天弃去孔中液体，补加 200L HAT 培养基，待融合集落长至孔底面积的 1/4 时，取上清进行抗体检测。DB42/T XXXXX20205A.1.7阳性杂交瘤细胞筛选用禽流感病毒 H7 亚型 HI 试验筛选阳性杂交瘤细胞。将细胞上清作为待检样品加入反应板中，同时设定 SP2/0 细胞培养上清作为阴性对照，免疫小鼠血清做为阳性对照。A.1.8有竞争效果的细胞株的筛选用禽流感病毒 H7 亚型 HI 试验筛选出阳性血清 1 份，阴性血清 1 份。将筛选出的阳性血清和阴性血清用样品稀释液 2 倍稀释，加入包被好的酶标板中，100L/孔，37作用30min。弃去孔中液体，洗涤 5 次，拍干，分别加入阳性细胞上清各 100L，37作用 30min。洗涤 5次，拍干，加入 1:5000 稀释的羊抗鼠 IgG-HRP，每孔加入 100