DB41T 2171-2021 牛妊娠诊断技术规程.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 43 41 河南省地方标准 DB41/T 21712021 牛妊娠诊断技术规程 2021-10-19 发布 2022-01-18 实施 河南省市场监督管理局 发 布 DB41/T 21712021 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 直肠检查.1 5 超声波诊断.2 6 妊娠相关糖蛋白检测.2 附录 A（规范性）直肠检查法不同妊娠时期牛子宫变化示例.5 附录 B（规范性）牛配后各时期 B 型超声波子宫切面示例.7 附录 C（规范性）溶液配制方法和要求.9 DB41/T 21712021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由河南省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：河南省奶牛生产性能测定中心、河南省种牛遗传性能测定中心、河南农业大学、河南省兽药饲料监察所。本文件主要起草人：张震、王新庄、闫跃飞、闫磊、汪聪勇、苏银池、林红新、薛永康、许杨、任小丽、刘欢、李静茹、皇超英、郑立、李秋平、白雪利、高娜、黄辉、岳婷婷、巩丹、侯玉芳、李娜、卜秋月。DB41/T 21712021 1 牛妊娠诊断技术规程 1 范围 本文件规定了直肠检查、超声波诊断、妊娠相关糖蛋白（pregnancy-associated glycoproteins,PAGs）检测等牛妊娠诊断方法的操作技术规程。本文件适用于牛妊娠诊断。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 10152 B型超声诊断设备 NY/T 3471 畜禽血液收集技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 妊娠诊断 采用临床或实验室的方法检查配种一定时间内的母牛是否妊娠、妊娠时间及胎儿发育情况的方法。3.2 孕囊 在胚胎发育的最初几周内围绕胚胎充满液体的结构，也是牛妊娠过程中通过超声发现妊娠的第一个结构。3.3 妊娠相关糖蛋白 母牛妊娠后胎盘的滋养层双核细胞与子宫上皮细胞融合后释放的一种蛋白。一般最早可在妊娠 15 d21 d的怀孕母牛血液中检测到，产后90 d后浓度降至最低。4 直肠检查 动物准备 4.1 动物使用颈夹或保定架保定配种45 d后的母牛。人员准备 4.2 操作人员检查手指甲并将手指甲剪短磨平，穿戴已消毒的工作服，操作手臂佩戴一次性长臂手套，并在手套外涂抹润滑剂。排空蓄粪4.3 DB41/T 21712021 2 操作人员直检手手指并拢，以4560角缓慢进入直肠，排空蓄粪。确定子宫颈位置 4.4 操作人员手臂前伸，摸到子宫体，顺子宫体回撤手臂，确定子宫位置。妊娠诊断 4.5 操作人员经直肠触摸探查母牛两侧子宫角是否存在大小和质地差异，判断是否存在孕囊和子叶，并跟踪大小变化情况，从而确定母牛是否妊娠。妊娠期牛子宫变化应符合附录A的规定。检查结束 4.6 检查结束后，将使用过的手套和工作服进行处置，同时记录检查结果。5 超声波诊断 动物准备 5.1 使用颈夹或保定架保定配种32 d60 d的母牛。人员准备 5.2 按4.2。排空蓄粪 5.3 按4.3。开机自检 5.4 选用符合GB 10152的B超仪。打开B超仪开关，待仪器设备自检正常后，设置或调整设备相关参数，按设备要求进行预热，根据B超仪屏幕影像质量调节灰度、对比度、增益度及近场、远场信号强度。获取影像 5.5 在B超仪探头部位涂抹相应耦合剂，将B超探头缓慢送入直肠30 cm50 cm处，深度可根据牛体型和妊娠状况进行适当调整，紧贴子宫不断缓慢移动调整探查角度，直至清晰影像出现。妊娠诊断 5.6 出现一个或多个规则的孕囊（黑色暗区）或者胎儿骨骼影像即可确认为妊娠。妊娠期牛子宫内孕囊及胎儿变化应符合附录B的规定。检查结束 5.7 检查结束后，将使用过的手套和工作服进行处置，擦拭B超仪探头并使用75%的酒精进行消毒，同时记录检查结果。6 妊娠相关糖蛋白检测 样品准备6.1 DB41/T 21712021 3 采集配种28 d后牛只血液并分离血清。采样、运输过程应符合NY/T 3471的相关要求。实验前准备 6.2 实验室温度调节设置18 25，并准备恒温箱、混匀器、酶标仪等仪器设备。检测程序 6.3 6.3.1 试剂配制 配制方法按附录C规定。6.3.2 包被 用包被液将牛PAGs单克隆抗体稀释至工作浓度，加入酶标板孔中，每孔100 L（每孔抗体含量约35 ng），在2 8 放置12 h。6.3.3 洗涤 弃去孔内包被液，用洗涤液洗板3次，每次300 L/孔，洗涤完毕后在吸水纸上拍干。6.3.4 封闭 每孔加入200L的封闭液，置37 孵育1 h。按6.3.3规定操作。6.3.5 加入待检样品 每孔加入50L样品缓冲液。分别将100L标准品（AF）和样品加入到相应孔中，加样后轻轻震荡混匀。覆膜，37 孵育60 min或室温（18 25）孵育90 min。6.3.6 洗板 孵育后洗板，甩尽酶标板内液体，每孔加300L洗涤液洗板，并在吸水纸上拍干，反复洗涤5次。6.3.7 加入酶标兔抗牛 PAGs 多克隆抗体 用洗涤液将酶标兔抗牛PAGs多克隆抗体稀释至标定浓度，每孔加100L酶标兔抗牛PAGs多克隆抗体，覆膜，37 避光孵育60 min或室温（18 25）避光孵育90 min。6.3.8 洗板 重复6.3.6的操作，并用干净纸巾将酶标板底部擦拭干净。6.3.9 显色反应 每孔加100L底物溶液。勿覆膜，室温（18 25）避光孵育30 min。6.3.10 终止反应 孵育完成后，每孔加50L反应终止液，轻轻晃动混匀。6.3.11 上机检测 15 min内用酶标仪在450 nm波长处测量各孔的光密度（OD值）。6.3.12 计算结果DB41/T 21712021 4 以标准品的浓度为横坐标（X），OD值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，相关系数（R2）应大于等于0.99。根据样品的OD值利用标准曲线计算出样品中PAGs浓度。结果判断 6.4 被检牛只PAGs检测浓度1 000 pg/mL时，结果判断为妊娠；PAGs检测浓度300 pg/mL时，结果判断为空怀状态；300 pg/mLPAGs检测浓度1 000 pg/mL时，结果判断为高风险，存在胚胎死亡风险，建议2周后复检。DB41/T 21712021 5 A A 附录A （规范性）直肠检查法不同妊娠时期牛子宫变化示例 A.1 未孕牛 子宫卵巢均位于骨盆腔内，2个子宫角大小相等，形状相似，弯曲如绵羊角状，角间沟清楚明显。触诊子宫有弹性，子宫角有收缩反应。卵巢上无妊娠黄体。A.2 怀孕牛 A.2.1 初期：子宫变化不大，子宫壁有弹性，孕角侧卵巢上有突出于卵巢表面的黄体，同时观察是否返情。A.2.2 1个月：孕角增厚变粗，不收缩，有弹性，孕角内有液体波动。空角收缩，有弹性，弯曲明显，角间沟清楚。图 A.1 妊娠 1 个月子宫情况示例 A.2.3 2个月：角间沟不清楚，分岔明显，子宫角、卵巢向腹腔沉入，孕角比空角大一倍，子宫角壁软而薄，有波动。图 A.2 妊娠 2 个月子宫情况示例 A.2.4 3个月：角间沟消失，子宫颈移至耻骨前缘，孕角有明显波动，有胎动。孕侧子宫中动脉开始出现较弱孕脉。DB41/T 21712021 6 图 A.3 妊娠 3 个月子宫情况示例 A.2.5 4个月：子宫沉入腹腔，可清楚摸到子叶，体积稍小于卵巢（如黄豆大小），孕侧子宫中动脉较清楚。A.2.6 5个月：两侧卵巢全沉入腹腔，不能或只能摸到子宫的一部分，子叶更大（如蚕豆大小），孕侧子宫中动脉明显，非孕侧出现孕脉。A.2.7 6个月：胎儿进入腹腔，子叶更大（如鸽子蛋大小），子宫中动脉粗大，孕脉明显。A.2.8 7个月：子叶如核桃大，两侧子宫中动脉均明显。A.2.9 8个月：子叶更大，两侧中动脉孕脉显著，胎儿上移。A.2.10 9个月：前置部分进入骨盆入口，两侧子宫动脉有显著孕脉。DB41/T 21712021 7 B B 附录B （规范性）牛配后各时期 B 型超声波子宫切面示例 B.1 各时期 B 型超声波子宫切面示例 出现一个或多个规则的孕囊暗区或者胎儿骨骼影像即可确认为早孕阳性（图B.2），否则为早孕阴性（图B.1）。图 B.1 未孕子宫角 图 B.2 子宫内囊暗区 牛孕后27 d（图B.3）、30 d（图B.4）、32 d（图B.5）、43 d（图B.6）、59 d（图B.7）、66 d（图B.8）的B型超声波子宫切面图示例如下：图 B.3 妊娠第 27 d 图 B.4 妊娠第 30 d DB41/T 21712021 8 图 B.5 妊娠第 32 d 图 B.6 妊娠第 43 d 图 B.7 妊娠第 59 d 图 B.8 妊娠第 66 d C C DB41/T 21712021 9 D 附录C （规范性）溶液配制方法和要求 C.1 洗涤液 将下列试剂按次序加入1 000 mL规格的容器中，加入800 mL蒸馏水充分溶解，用1 mol/L盐酸（HCl）或1 mol/L氢氧化钠（NaOH）调节至pH 7.4，定容至1 000 mL。氯化钠（NaCl）氯化钾（KCl）磷酸氢二钠（Na2HPO4-12H2O）磷酸二氢钾（KH2PO4）吐温-20（Tween-20）加蒸馏水至 8.0 g 0.2 g 0.2 g 2.9 g 0.5 mL 1 000 mL C.2 包被液 包被液为碳酸盐缓冲液（0.025 mol/L，pH 9.6）。将下列试剂按次序加入1 000 mL规格的容器中，加入800 mL蒸馏水充分溶解，用1 mol/L盐酸（HCl）或1 mol/L氢氧化钠（NaOH）调节至pH 9.6，定容至1 000 mL。碳酸钠（Na2CO3）碳酸氢钠（NaHCO3）加蒸馏水至 1.59 g 2.93 g 1 000 mL C.3 封闭液（5%脱脂奶）洗涤液 脱脂奶粉 100 mL 5 g C.4 底物 四甲基联苯二胺 无水乙醇（C2H5OH）加蒸馏水至 20 mg 10 mL 1 000 mL C.5 终止液 取98%浓硫酸55.5 mL缓慢加入444.5 mL双蒸水中，混匀，室温保存。C.6 标准品 取纯化的妊娠相关糖蛋白用洗涤液分别稀释至3 500 pg/mL、2 370 pg/mL、1 610 pg/mL、1 090 pg/mL、500 pg/mL和 0 pg/mL，并分别命名为标准品A、B、C、D、E、F。