DB37T 4058-2020 水生动物细菌性病原检测技术规范.pdf

ICS 65.150 B 50 DB37 山东省地方标准 DB37/T 40582020 水生动物细菌性病原检测技术规范 Inspection protocol for bacterial pathogens of aquatic animals 2020-07-09 发布 2020-08-09 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 40582020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省渔业标准化委员会（鲁TC03）归口。本标准起草单位：威海海洋职业学院、山东省渔业技术推广站、中国科学院水生生物研究所、江苏省渔业技术推广中心、威海市渔业技术推广站。本标准主要起草人：侯仕营、刘朋、刘晓燕、李爱华、董济军、刘缵延、吴亚锋、马湘君、尹相菡、刘振华。DB37/T 40582020 1 水生动物细菌性病原检测技术规范 1 范围 本标准规定了水生动物细菌性病原（Bacterial pathogens of aquatic animals）检测的试剂与材料、仪器设备、采样、细菌性病原分离培养和病原菌检测。本标准适用于山东省水生动物常见细菌性病原检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 SC/T 70142006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术 SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3 试剂与材料 试剂与材料应符合GB 4789.28和附录A的规定。4 仪器设备 按照SC/T 7201.1的规定执行。5 采样 5.1 采样用具 应使用无菌采样用具。5.2 采样数量、个体要求、采集部位 按照SC/T 70142006中第6章的规定执行。5.3 样品运输及保存 按照SN/T 2123的规定执行。6 细菌性病原分离培养 6.1 分离培养 DB37/T 40582020 2 6.1.1 兼性厌氧菌和需氧菌的分离培养 规范取样后，采用稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法等方式，在28 30 培养24 h；低温下取样应在15 18 同步培养24 h。6.1.2 厌氧菌的分离培养 将处理好的平板置于玻璃干燥器，并在其上方放置连二亚硫酸钠和无水碳酸钠（分别研细均匀，临用前混合置于一平皿内）各30 g/1 000 mL容积，然后将干燥器盖严，用凡士林密封，在28 30 培养24 h；低温下取样则应在15 18 同步培养24 h。严格厌氧菌的分离培养应在厌氧工作台中进行。6.2 纯培养 6.2.1 兼性厌氧菌和需氧菌的纯培养 挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.1的方法培养。6.2.2 厌氧菌的纯培养 挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.2的方法培养。6.3 多次纯培养 若经过纯培养后，未能得到形态特征基本一致的单菌落，可进行多次纯培养，直到获得形态特征基本一致的单菌落，操作步骤应符合6.2的要求。7 病原菌检测 7.1 病原菌 16S rDNA 序列分析 7.1.1 菌落 PCR 按照附录B执行。7.1.2 结果判定 7.1.2.1 PCR 结果可靠 DNA Marker标准样品出现清晰的梯度条带，阳性对照可见1472 bp左右DNA条带，且阴性和空白对照样品无条带出现，则PCR实验结果可靠，可进行样品分析。7.1.2.2 电泳失败 DNA Marker标准样品未出现条带，则电泳失败，应检查电泳试剂重新进行电泳。7.1.2.3 检测结果无效 DNA Marker标准样品出现清晰的梯度条带，阳性对照无条带或者DNA条带非1472 bp左右，或者在阴性对照和空白对照样品中出现了DNA条带，则试验结果无效，应重新进行PCR扩增。7.1.3 克隆、测序和比对 DB37/T 40582020 3 将7.1.2样品扩增条带克隆、测序，序列输入到NCBI网站进行比对，确定细菌的属种。7.2 病原菌生化特性检测 按照SC/T 70142006中的9.4规定执行。7.3 结果综合判定 需要鉴定病原菌到属依据7.1.3结果进行判定，需要进一步鉴定到种应结合7.2结果进行综合判定。DB37/T 40582020 4 A A 附 录 A（规范性附录）试剂的配制 A.1 TE缓冲液 A.1.1 A液：1 mol/L TrisHCl(pH8.0)称取Tris碱6.06 g，加去离子水40 mL溶解，滴加浓HCl约2 mL调pH至8.0，定容至50 mL。A.1.2 B液：0.5 mol/L EDTA(pH8.0)称取Na2EDTA2H2O 9.31 g，加超纯水35 mL，剧烈搅拌，用约1 g NaOH颗粒调pH至8.0，定容至50 mL（Na2EDTA2H2O需加入NaOH将pH调至接近8.0时才会溶解）。A.1.3 TE缓冲液 量取A液5 mL，B液1 mL于烧杯中，加400 mL去离子水混合，调pH至8.0，定容至500 mL。A.2 1TAE缓冲液 称取Tris 242.0 g，Na2EDTA 2H2O 37.2 g于1 L烧杯中，加800 mL去离子水充分搅拌溶解，再加入57.1 mL醋酸，充分混匀。最后以去离子水定容至1 000 mL即为50TAE缓冲液，使用时稀释50倍即可。DB37/T 40582020 5 B B 附 录 B（规范性附录）菌落 PCR 测定 B.1 制备DNA模板 用无菌牙签挑取单个菌落到0.2 mL PCR管中，加入10 L无菌1TE（见附录A.1）缓冲液弹击混匀，标记，盖紧，100 煮沸5 min，-20 冷冻5 min（循环2次），5 000 r/min离心1 min，取上清液检测DNA模板浓度，用于后续PCR扩增。当样本量少时也可采用合适的试剂盒制备DNA模板。B.2 PCR扩增 采用50 L PCR反应体系：DNA模板浓度范围为0.2 ng/L2 ng/L，（用核酸测定仪测定DNA模板浓度，根据浓度值计算模板添加体积），10PCR Buffer（含Mg2+1.5 mM）5 L，dNTP（10 mM）1 L，上游引物（27F）：5AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3，下游引物（1492R）：5TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T 3（25 M）各2 L，Taq酶（2 U/L）1 L2 L，去离子水补至50 L，混匀，稍离心。反应管置于PCR仪中，首先95 预变性5 min；主循环30次：94 30 s，50 退火30 s，72 30 s（时间可根据片段长度调整）；终延伸72 10 min，4 保存。注：不同细菌PCR程序可不同。B.3 电泳检测 设置阳性样品对照（如大肠杆菌DNA）、阴性样品（如鱼的基因组DNA或细菌质粒DNA）对照、空白对照（无DNA）。1TAE（见附录A.2）缓冲液配置含核酸染料的2%琼脂糖凝胶，PCR扩增产物与6上样缓冲液混合，同时以DL2000或同等大小的DNA Marker标准样品为对照。10 V/cm电泳30 min，凝胶成像系统拍摄电泳结果。_