DB41T 1729-2018 饲料添加剂葡萄糖氧化酶活力的测定 分光光度法.pdf

ICS 65.120 B 05 DB41 河南省地方标准 DB 41/T 17292018 饲料添加剂葡萄糖氧化酶活力的测定 分光光度法 2018-11-26 发布 2019-02-26 实施 河南省质量技术监督局 发 布 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17292018 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位:河南海瑞正检测技术有限公司、河南牧业经济学院、河南省粮油饲料产品质量监督检验中心、河南省兽药饲料监察所、河南省粮油科学研究所有限公司。本标准主要起草人:李贤、曹明月、文英会、侯林丛、高海军、魏广辉、谭旭信、刘文杰、周江滨、王莉莉。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17292018 1 饲料添加剂葡萄糖氧化酶活力的测定 分光光度法 1 范围 本标准规定了测定饲料添加剂葡萄糖氧化酶活力的分光光度方法。本标准适用于饲料添加剂、混合型饲料添加剂及其复合酶。本方法的定量限为 60 U/g。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 葡萄糖氧化酶活力 在30、pH为6.0 的条件下，每分钟能把1 mol 的葡萄糖氧化成-D-葡萄糖酸和过氧化氢所需的酶量，定义为一个葡萄糖氧化酶活力单位（U）。4 原理 在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖发生氧化反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢与无色的还原型 4-氨基安替比林和苯酚在辣根过氧化物酶的催化作用下，生成红色的醌亚胺，生成醌亚胺的量与反应液中葡萄糖氧化酶的活力成正比。通过分光光度计比色测定反应液的吸光度，计算出葡萄糖氧化酶的活力。5 试剂或材料 5.1 磷酸缓冲溶液（pH 6.0）:分别称取 12.1 g 一水磷酸二氢钠和 2.189 g（精确至 0.001 g）二水磷酸氢二钠，加入约 800 mL 水，完全溶解后调节 pH 为 6.00.02，定容至 1 000 mL。5.2 葡萄糖溶液（180 g/L）:称取 18.0 g 无水葡萄糖，用磷酸缓冲液（5.1）溶解，定容至 100 mL。5.3 4-氨基安替比林溶液（50 g/L）:称取 5 g 4-氨基安替比林（精确至 0.001 g），加水溶解，定容至 100 mL，棕色试剂瓶存放。5.4 苯酚溶液（11 g/L）:称取 1.1 g 苯酚（精确至 0.001 g），加水溶解，定容至 100 mL。5.5 辣根过氧化物酶（HRP）液:称取 0.0015 g（精确至 0.000 1 g）辣根过氧化物酶于 5 mL 离心管中，加入 3 mL 水溶解，备用。注：除非另有说明，试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 中规定的三级水。6 仪器设备 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17292018 2 6.1 分样筛:孔径为 0.25 mm。6.2 分析天平:感量 0.1 mg。6.3 pH 计:精度为0.01。6.4 磁力搅拌器:附加热功能。6.5 恒温水浴锅:30。6.6 秒表:每小时误差不超过 5 s。6.7 分光光度计:吸光度 500 nm。6.8 离心机:离心力不低于为 2 000 g。7 试验步骤 7.1 试样酶液的制备 固态试样应粉碎或充分碾碎，过0.25 mm 孔径筛。称取1 g 试样两份，精确至0.000 1 g，分别置于200 mL 锥形瓶中，加入50 mL 磷酸缓冲溶液（5.1）。摇床或磁力搅拌提取30 min，上离心机4000 r/min 离心5 min，取上清液，上清液再用缓冲溶液（5.1）做二次稀释，使稀释后的待测酶液中葡糖糖氧化酶活力控制在6 U/mL10 U/mL 之间。7.2 测定 取3支试管，分别移取0.2 mL 辣根过氧化物酶液（5.5），加入4 mL 磷酸缓冲液（5.1），振摇3 s，加入0.6 mL 葡萄糖溶液（5.2），振摇3 s，加入0.8 mL 苯酚溶液（5.4），振摇3 s，再加入0.2 mL 4-氨基安替比林溶液（5.3），振荡混匀。30 0.2 水浴5 min，取出。向其中1支试管中加入0.2 mL 水，作为空白调零。向另外2支试管中加入0.2 mL 试样溶液，振荡混合，立即用1 cm 比色皿，在500 nm 处测定吸光度为A0，再准确反应1 min 后，读取吸光度值A1，得出 A=A1-A0。8 试验数据处理 试样稀释液中葡萄糖氧化酶活力以 X0 表示，单位为酶活力单位每毫升（U/mL），按式（1）计算:10008870dAtBfAX （1）式中:f 酶液稀释倍数；B 反应液体积（mL）；t 酶解反应时间，单位为分（min）；A 加入样品体积（mL）；d 比色皿的厚度（cm）；887 消光系数（LmoL-1cm-1）；X0 值应在6 U/mL10 U/mL之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。试样葡萄糖氧化酶的活力以 X 表示，单位为酶活力单位每克（U/g）或者酶活力单位每毫升（U/mL），按式（2）计算:nXX0 （2）河南省地方标准公共服务平台DB41/T 17292018 3 式中:X0 试样稀释样中葡萄糖氧化酶活力，单位为酶活力单位每毫升（U/mL）；n 试样的总稀释倍数；计算结果保留三位有效数字。9 精密度 在重复性条件下，两次独立测定结果的相对误差不超过 8%。_ 河南省地方标准公共服务平台