DB61T 1158.4-2018 桑黄标准综合体 第4部分：液体菌种生产技术规程.pdf

ICS 65.020.01 B 39 DB61 陕西省地方标准 DB 61/T 1158.42018 桑黄标准综合体 第 4 部分：液体菌种生产技术规程 Integrated Standards of Phellinus spp.Part 4：Technical Rules for Liquid Inoculum Preparation 2018-05-01 发布 2018-06-01 实施 陕西省质量技术监督局 发 布 DB61/T 1158.42018 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 栽培场地.1 4 栽培环境.1 5 栽培设施.2 附录 A（规范性附录）食用菌生产场所处理方法.3 DB61/T 1158.42018 II 前 言 DB61/T 11582018桑黄标准综合体分为六个部分：第 1 部分：生产环境；第 2 部分：菌种；第 3 部分：菌种生产技术规程；第 4 部分：液体菌种生产技术规程；第 5 部分：桑黄栽培技术规程；第 6 部分：子实体干品质量要求。本部分为 DB61/T 11582018 的第 4 部分。本部分按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本部分由陕西省农业厅提出并归口。本部分起草单位：陕西省微生物研究所、杨凌康宇生物科技有限公司、陕西省园艺蚕桑工作站。本部分主要起草人：雷萍、吴亚召、张文隽、渠敬峰、王周平、张伟兵、霍国琴、赵玉鹏、马莹、杜艳。本部分由陕西省微生物研究所负责解释。本部分首次发布。联系信息如下：单位：陕西省微生物研究所 地址：西安市雁塔区西影路 76 号 邮编：710043 电话：029-82357027 DB61/T 1158.42018 1 桑黄标准综合体 第 4 部分：液体菌种生产技术规程 1 范围 DB61/T 1158 的本部分规定了桑黄液体菌种的生产条件、生产工艺及标签、贮存。本部分适用于袋料栽培的桑黄液体菌种生产。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.28 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB 5749 生活饮用水卫生标准 NY/T 528食用菌菌种生产技术规程 NY 5099 无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求 DB61/T 1158.3 桑黄标准综合体 第3部分：菌种生产技术规程 食用菌菌种管理办法中华人民共和国农业部第62号令（2006年3月27日）3 生产条件 3.1 技术人员 按照食用菌菌种管理办法的规定配备菌种生产的专业技术人员。3.2 生产场地 3.2.1 地势干燥、空气优良、通风良好、水源充足且符合 GB 5749 生活饮用水卫生标准、排水畅通、交通便利，电源充足，有硬质路面排水良好的道路。3.2.2 环境卫生应符合 NY/T 528 的规定。300m 之内无禽畜舍，无垃圾场，无污水、粉尘污染源。3.3 生产厂房 3.3.1 液体菌种生产车间 3.3.1.1 地面应防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，应有 1.0%1.5%的排水坡度和良好的排水系统。3.3.1.2 墙壁和天花板应具有防潮、防霉、防水功能，且易清洗；电力满足生产要求，通风良好。3.3.2 液体菌种接种间 3.3.2.1 应设置缓冲间及与接种人数相适应的更衣室。3.3.2.2 车间入口处设置洗手、消毒和干手设备。放置封闭式废物桶，安装排风设备，门窗应安装防蚊蝇纱网。DB61/T 1158.42018 2 3.3.3 发酵室 内壁和房顶光滑易清洗和消毒。3.4 设施设备 按照DB61/T 1158.3中3.3要求配备。3.5 培养基质 应符合NY 5099无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求的规定。4 生产工艺 4.1 工艺流程 母种摇瓶种制备种子罐菌种制备液体菌种发酵菌种检测。4.2 摇瓶种制备 4.2.1 培养基 按照附录A规定配制。4.2.2 装液量 采用500mL的常规三角瓶，每瓶装量为100mL150mL，八层纱布和牛皮纸封口。4.2.3 灭菌 在121126，0.14MPa0.17MPa的压力下，保持30分钟。4.2.4 接种 将灭菌后的培养基冷却至30以下，无菌条件下每瓶接入0.3cm20.5cm2母种1块。4.2.5 培养（271）静止培养24h后，移至摇床130r/min150r/min振荡频率下培养48h，再调至150r/min180r/min，继续培养72h96h。4.2.6 移种标准 4.2.6.1 菌体形态：桑黄菌丝长分支，发酵液清香，颜色清亮、浅褐色，菌丝球多，菌液稍有黏稠。4.2.6.2 菌丝量：10%15%（湿重）。4.2.6.3 酸碱度：发酵液 pH5.05.5。4.2.6.4 镜检：平皿检验无杂菌。4.3 种子罐菌种制备 4.3.1 培养基 按照附录A规定配制。DB61/T 1158.42018 3 4.3.2 装液量 发酵罐体积的60%。4.3.3 灭菌 用夹层预热培养基至80后，蒸汽进罐升温至121124，0.11MPa0.14MPa保压恒温40min。4.3.4 接种 在无菌条件下接种，接种量为10%15%；接种后调节进、排气阀，使罐压保持在0.02MPa0.04MPa之间。4.3.5 培养 搅拌转速120r/min150r/min，温度（271）培养120h。定时用肉汤培养基（按照附录C规定配制）检查发酵液的无菌情况，显微镜检查菌体的状况。每隔8h或12h取样液进行一次无菌检验。用2支肉汤试管及1只培养皿（培养基按照附录D规定配制）同时检验。肉汤连续3次发生变色反应（由红色变为黄色）或产生混浊，平板培养连续3次有杂菌菌落出现为染菌。肉汤阳性反应不明显，发酵液各项参数表明确有可疑的染菌反应，经镜检证实有杂菌存在，也应判断为染菌。4.4 液体菌种发酵 4.4.1 液体培养基制作 4.4.1.1 按照附录 B 规定配制。水质应符合 GB 5749 的规定。4.4.1.2 灭菌按照发酵罐厂家型号使用说明书的要求进行操作。4.4.2 菌种接入罐体 在无菌条件下接种，接种量为10%15%。4.4.3 液体菌种培养 罐温：（282）。罐压：（0.30.4）105Pa。通气量：10.5V/Vmin。搅拌速度：150r/min180r/min。培养时间：96h120h。4.5 液体菌种检测 接种后第 4 d 进行检测，按照无菌操作取样，将样液接于 GB 4789.28 规定的试管斜面或培养皿的培养基上，（282）培养 2 d5 d，采用显微镜和感官观察菌丝生长状况。若无细菌、霉菌等杂菌菌落生长，则表明该样品无杂菌污染。5 液体菌种合格指标 5.1 感官指标 DB61/T 1158.42018 4 5.1.1 菌丝形态与色泽：具有“毛刺”的球状菌丝体呈米白色，菌液呈棕色。5.1.2 菌液形态：菌液稍粘稠，有大量菌丝体悬浮、分布均匀、不上浮、不下沉、不迅速分层，菌球间液体不浑浊。5.1.3 菌液气味：有桑黄菌液体培养时特有的香气，无酸、臭味等，培养器排气口气味正常。5.2 理化指标 5.2.1 酸碱度：pH 值 5.56.0。5.2.2 菌丝量：菌丝湿重（g/L）80。5.2.3 菌丝形态和杂菌鉴别：显微镜下可见桑黄菌种液体培养中特有的菌丝形态，初始阶段菌丝壁薄，黄绿色透明，顶端钝圆，有一主干，极少分支，具不明显的简单分隔，原生质丰富，直径 0.3m1m。老熟菌丝隔膜处常隆起，骨棒状，菌丝分支处偶有直角分支。深层发酵培养菌丝体大量分布，菌丝缠绕结成球状，表面有凸起的菌刺，菌刺形状分支较多。菌丝无锁状联合。无霉菌菌丝、酵母和细菌菌体。6 标签、贮存 6.1 标签 生产的菌种必须贴有菌种质量合格标签，注明菌种种类、级别、品种、生产单位、接种日期。6.2 贮存 6.2.1 摇瓶种保存 4、暗光条件下可保存5d7d。6.2.2 种子罐液体菌种保存 1520可保存1d2d。DB61/T 1158.42018 5 A A 附 录 A（规范性附录）常用摇瓶种培养基 A.1 常用摇瓶种培养基 A.1.1 葡萄糖3%，豆饼粉2%，玉米粉1%，酵母粉0.5%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，硫酸镁0.05%，pH值6.0。玉米粉，豆饼粉均过80目筛。A.1.2 可溶性淀粉3%6%，白砂糖1%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%，酵母膏0.1%，pH值6.0。DB61/T 1158.42018 6 B B 附 录 B（规范性附录）常用发酵罐培养基 B.1 常用发酵罐培养基 B.1.1 葡萄糖3%，豆饼粉2%，玉米粉1%，酵母粉0.5%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，硫酸镁0.05%，pH值6.0。玉米粉，豆饼粉均过80目筛。B.1.2 可溶性淀粉3%6%，白砂糖1%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%，酵母膏0.1%，pH值6。B.1.3 玉米粉1%、麸皮1%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、KH2PO4溶液0.1%、MgSO4溶液0.05%、维生素B110mg/100mL、pH自然。玉米粉，麸皮粉碎均过80目筛。DB61/T 1158.42018 7 C C 附 录 C（规范性附录）肉汤培养基 C.1 肉汤培养基 C.1.1 牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，酚红溶液2mL，葡萄糖3g，水1000mL，pH7.37.6（灭菌前）。C.1.2 酚红溶液：取酚红1g，用10mL95乙醇溶解，加90mL蒸馏水。DB61/T 1158.42018 8 D D 附 录 D（规范性附录）平板杂菌检验培养基 D.1 平板杂菌检验培养基 牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，琼脂20g，葡萄糖3g，水1000mL。_